| 查看: 1453 | 回复: 8 | ||
| 本帖产生 1 个 博学EPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
wuweibewin金虫 (正式写手)
|
[求助]
PCR有关问题
|
|
|
本人从师姐那里获得了一对引物，用于棉花基因组中某个外源基因的检测。我用这个引物也用了有两年了吧，一直虽然有杂带，但是可以找到清晰的目的带。 结果不知道为何，从今年六月份开始，不知怎么回事，这天引物突然失灵了一般，不论怎么试，除了质粒有带，其余株系都没有带，连非特异性带都没有！（声明失灵的前一晚上我还做出来了，第二天突然就不知怎么回事就P不出来了）！然后我在以前的条件下（退火温度和体系相同），做了至少20多次，结果全部一样，各株系均没带（正常下阴性也有大量非特异扩增）！ 于是我 首先利用其它基因的引物对这一批DNA进行扩增，发现能够扩增出来；同时我又提取了一些新的样品，结果仍然一样——我觉得可以证明DNA样品问题不大！ 然后我让我师妹和同学替我做了几次，结果和我做的一样，我PCR操作至少也做了百八十批了！---操作应该没有问题 PCR仪使用的是EPPENDOF和thermo的，用于扩增其他基因都没有问题————排除PCR故障 引物我前后利用华大和博尚合成了三四批，均得到同样结果，引物序列均能在基因序列上找到，且与之前报告单序列完全一样 我同时利用PCR仪进行了多次温度梯度PCR，结果所有温度梯度结果也都是一样！ taq酶利用TAKARA和北京全是金结果基本一致，且换用多个批次的taq酶！没有结果！同时taq酶对其他基因的扩增良好！ PCR的体系完全根据taq酶说明书进行！也曾经尝试过TAQ的浓度梯度/dntp浓度梯度/MG离子梯度，无果！ 这个问题让人很是头疼！ 异常发现：发现凝胶电泳的500bp一下，呈涂抹状，我认为是大量引物没有反应导致的引物二聚体，但或许有其他原因！ 我为此已经进行了90多轮PCR，换了400多个样品（十批）！ 还请各位高手批评指正！！！不胜感激！！ 之前的结果   现在结果  部分批次模板电泳  mg离子梯度  温度梯度  Dntp梯度  taq梯度  模板浓度梯度  [ Last edited by wuweibewin on 2011-7-24 at 22:25 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
283求调剂，工科！
已经有8人回复
-
285求调剂
已经有10人回复
-
278求调剂
已经有31人回复
-
08工学 309分求调剂
已经有5人回复
-
求调剂
已经有6人回复
-
296求调剂
已经有6人回复
-
材料复试求调剂
已经有15人回复
-
297求调剂
已经有24人回复
-
计算机类求调剂，22408-274分
已经有6人回复
-
化学工程调剂289
已经有39人回复
wuweibewin
金虫 (正式写手)
- 博学EPI: 14
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 673.3
- 散金: 195
- 红花: 8
- 帖子: 634
- 在线: 42.8小时
- 虫号: 738179
- 注册: 2009-04-02
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
9楼2011-11-06 15:11:12
2楼2011-07-24 22:46:38
wuweibewin
金虫 (正式写手)
- 博学EPI: 14
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 673.3
- 散金: 195
- 红花: 8
- 帖子: 634
- 在线: 42.8小时
- 虫号: 738179
- 注册: 2009-04-02
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
3楼2011-07-25 14:08:16
4楼2011-07-25 14:25:09
