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wuweibewin金虫 (正式写手)
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[求助]
PCR有关问题
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本人从师姐那里获得了一对引物，用于棉花基因组中某个外源基因的检测。我用这个引物也用了有两年了吧，一直虽然有杂带，但是可以找到清晰的目的带。 结果不知道为何，从今年六月份开始，不知怎么回事，这天引物突然失灵了一般，不论怎么试，除了质粒有带，其余株系都没有带，连非特异性带都没有！（声明失灵的前一晚上我还做出来了，第二天突然就不知怎么回事就P不出来了）！然后我在以前的条件下（退火温度和体系相同），做了至少20多次，结果全部一样，各株系均没带（正常下阴性也有大量非特异扩增）！ 于是我 首先利用其它基因的引物对这一批DNA进行扩增，发现能够扩增出来；同时我又提取了一些新的样品，结果仍然一样——我觉得可以证明DNA样品问题不大！ 然后我让我师妹和同学替我做了几次，结果和我做的一样，我PCR操作至少也做了百八十批了！---操作应该没有问题 PCR仪使用的是EPPENDOF和thermo的，用于扩增其他基因都没有问题————排除PCR故障 引物我前后利用华大和博尚合成了三四批，均得到同样结果，引物序列均能在基因序列上找到，且与之前报告单序列完全一样 我同时利用PCR仪进行了多次温度梯度PCR，结果所有温度梯度结果也都是一样！ taq酶利用TAKARA和北京全是金结果基本一致，且换用多个批次的taq酶！没有结果！同时taq酶对其他基因的扩增良好！ PCR的体系完全根据taq酶说明书进行！也曾经尝试过TAQ的浓度梯度/dntp浓度梯度/MG离子梯度，无果！ 这个问题让人很是头疼！ 异常发现：发现凝胶电泳的500bp一下，呈涂抹状，我认为是大量引物没有反应导致的引物二聚体，但或许有其他原因！ 我为此已经进行了90多轮PCR，换了400多个样品（十批）！ 还请各位高手批评指正！！！不胜感激！！ 之前的结果   现在结果  部分批次模板电泳  mg离子梯度  温度梯度  Dntp梯度  taq梯度  模板浓度梯度  [ Last edited by wuweibewin on 2011-7-24 at 22:25 ] |
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4楼2011-07-25 14:25:09
2楼2011-07-24 22:46:38
wuweibewin
金虫 (正式写手)
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3楼2011-07-25 14:08:16
wuweibewin
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5楼2011-07-25 21:45:51
