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wuweibewin

金虫 (正式写手)

[求助] PCR有关问题

本人从师姐那里获得了一对引物，用于棉花基因组中某个外源基因的检测。我用这个引物也用了有两年了吧，一直虽然有杂带，但是可以找到清晰的目的带。
结果不知道为何，从今年六月份开始，不知怎么回事，这天引物突然失灵了一般，不论怎么试，除了质粒有带，其余株系都没有带，连非特异性带都没有！（声明失灵的前一晚上我还做出来了，第二天突然就不知怎么回事就P不出来了）！然后我在以前的条件下（退火温度和体系相同），做了至少20多次，结果全部一样，各株系均没带（正常下阴性也有大量非特异扩增）！
于是我
首先利用其它基因的引物对这一批DNA进行扩增，发现能够扩增出来；同时我又提取了一些新的样品，结果仍然一样——我觉得可以证明DNA样品问题不大！
然后我让我师妹和同学替我做了几次，结果和我做的一样，我PCR操作至少也做了百八十批了！---操作应该没有问题
PCR仪使用的是EPPENDOF和thermo的，用于扩增其他基因都没有问题————排除PCR故障
引物我前后利用华大和博尚合成了三四批，均得到同样结果，引物序列均能在基因序列上找到，且与之前报告单序列完全一样
我同时利用PCR仪进行了多次温度梯度PCR，结果所有温度梯度结果也都是一样！
taq酶利用TAKARA和北京全是金结果基本一致，且换用多个批次的taq酶！没有结果！同时taq酶对其他基因的扩增良好！

PCR的体系完全根据taq酶说明书进行！也曾经尝试过TAQ的浓度梯度/dntp浓度梯度/MG离子梯度，无果！
这个问题让人很是头疼！

异常发现：发现凝胶电泳的500bp一下，呈涂抹状，我认为是大量引物没有反应导致的引物二聚体，但或许有其他原因！
我为此已经进行了90多轮PCR，换了400多个样品（十批）！
还请各位高手批评指正！！！不胜感激！！
之前的结果



现在结果

部分批次模板电泳

mg离子梯度

温度梯度

Dntp梯度

taq梯度

模板浓度梯度

[ Last edited by wuweibewin on 2011-7-24 at 22:25 ]
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wuwei_hello@163.com
1楼2011-07-24 22:17:45
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qwky2010

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

wuweibewin(金币+5): 问题已经解决！！谢谢您的回帖！请见九楼 2011-11-06 15:14:06
wuweibewin(金币+5): 2011-11-06 15:14:42
"引物我前后利用华大和博尚合成了三四批，均得到同样结果，引物序列均能在基因序列上找到，且与之前报告单序列完全一样"
你那个模板浓度太大了，我们一般都看不到模板的
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天道酬勤
2楼2011-07-24 22:46:38
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wuweibewin

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qwky2010 at 2011-07-24 22:46:38:
"引物我前后利用华大和博尚合成了三四批，均得到同样结果，引物序列均能在基因序列上找到，且与之前报告单序列完全一样"
你那个模板浓度太大了，我们一般都看不到模板的

我们做PCR经常电泳时都能看见模板带!基本没有影响！我也做了模板梯度也没见有效果，虽然只做了四个梯度！
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wuwei_hello@163.com
3楼2011-07-25 14:08:16
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qwky2010

金虫 (著名写手)
如果能够确保试剂、模板、引物都没有问题，建议尝试降落pcr, 不用搞那么复杂 ，
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天道酬勤
4楼2011-07-25 14:25:09
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wuweibewin

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qwky2010 at 2011-07-25 14:25:09:
如果能够确保试剂、模板、引物都没有问题，建议尝试降落pcr, 不用搞那么复杂 ，

降落PCR我想过，不过那似乎是减少杂带使用的！我现在遇到的问题是P不出来带！！情况并不相同！
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wuwei_hello@163.com
5楼2011-07-25 21:45:51
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cularmy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

wuweibewin(金币+10, 博学EPI+1): 问题已经解决！！谢谢您的回帖！ 2011-11-06 15:12:29
从图上看，你的引物二聚体那么亮，引物都被消耗了，那会有带，用热启动试一下吧。
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6楼2011-08-05 11:43:17
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龙开聪

金虫 (小有名气)

贵是一种态度

【答案】应助回帖

wuweibewin(金币+5): 问题已经解决！！谢谢您的回帖！请见九楼 2011-11-06 15:14:29
不知楼主问题是否已经解决，我遇到了你同样的问题，和你几乎一模一样，现在任没解决呢，如果解决希望得到你的帮助
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挺住
7楼2011-08-18 20:18:42
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木棉花语

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wuweibewin(金币+5): 引物全是刚刚合成的！问题已经解决，请见九楼！ 2011-11-06 15:13:37
我看了 觉得是引物的问题吧 你是不是放的时间太久了 反正跑出来的引物二聚体那么亮肯定有问题，而且之前扩的也是有那么多非特异条带啊为什么不再重新设计一对引物呢
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平安喜乐
8楼2011-08-19 13:56:47
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wuweibewin

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 龙开聪 at 2011-08-18 20:18:42:
不知楼主问题是否已经解决，我遇到了你同样的问题，和你几乎一模一样，现在任没解决呢，如果解决希望得到你的帮助

问题在于DNTP浓度搞错了！！把10mM当成了2.5mM，导致的！但是改回来结果还是不理想，我就单方面提高了Mg离子浓度！提高了1/4，效果就很好了！不但出现了目的带，而且特异性也增强了!
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wuwei_hello@163.com
9楼2011-11-06 15:11:12
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