应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？
52/1返回列表
查看: 1907  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？

烦请各位帮帮忙   两个外显子  200bp 和1000bp的  重叠延伸pcr扩出1200的  胶回收后  用1200的作为模板  却扩不出来了     而且还有一条250左右的片段  为什么啊 ？问题可能出在哪儿呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
幸福只道是寻常
1楼 2011-07-22 22:37:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-22 12:07:53
追寻风轻扬(金币+1): 谢谢你！ 2011-09-03 17:07:11
taq酶会加尾的。。。
重叠PCR最要注意的就是用高保真酶！！！！
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-08-22 09:26:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-24 09:13:01
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右），A的左端和B的右端额外多扩几个到几十个碱基；另外再设计一对嵌套引物，位点就在你需要的A的左端和B的右端，用它来扩增融合产物，得到你真正需要的产物。一句话，就是融合时使得融合产物比想要的产物长一点，之后再用一对新的引物把目的产物P出来。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-07-23 17:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-23 17:10:54:
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右 ...

谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢谢啦.
赞一下 回复此楼
幸福只道是寻常
3楼2011-07-26 22:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-07-30 23:33:59
引用回帖:
Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？ ...

PCR扩增有1%的突变率，也有可能是你扩增的片段突变了。
引物的问题也不能排除。
在两端再加一些片段能保证扩增方向以及减少扩增过程中的错配。
赞一下(1人) 回复此楼
净——静——竞——进
4楼2011-07-26 22:44:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +5 瞬息宇宙 2026-08-10 6/300 2026-08-10 10:38 by Tide man
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +9 Lanmanbaby 2026-08-09 17/850 2026-08-10 10:35 by Tide man
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +7 yufeiwaner 2026-08-09 7/350 2026-08-10 09:08 by zju2000
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 好奇怪的filecode +3 布布和一二 2026-08-08 4/200 2026-08-08 17:46 by zhanghaozhu
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭