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犹寒

铁虫 (初入文坛)

[交流] TA克隆 已有4人参与

请问：
     我用takara的试剂盒做克隆，目的片段是PCR割胶回收的片段，长度从300bp-700bp都有，但是连接出来的蓝白筛选很好，有很多白斑，但是，送去测序后，测出来好多的空质粒，不知道是什么原因，如果是没连上，那应该是蓝斑才对啊，为什么那么多白斑都是质粒呢？
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1楼 2011-07-21 09:33:26
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anlewo7777

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 说得很好！ 2011-07-21 11:27:29
你可以控制一下检查的时间，最好是16小时以内，时间长了，氨苄降解到不能抑制未转化菌生长，可能会挑到没有质粒的菌；至于假阳性，也可能是你的X-GAL涂的不好，不行你就直接加到培养基里吧；另外，你挑的阳性克隆可以先提一下质粒，看一下有没有质粒变长再送去测序
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2楼2011-07-21 10:32:56
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healerly

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流！一般都是检验过有外源片段连进去再测序呢。 2011-07-21 11:28:05
本帖内容被屏蔽
3楼2011-07-21 10:48:46
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小米饭

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
最近我也有这样的情况发生 蓝白斑很明显 挑的白斑若干
双酶切检验只有载体条带 外源片段在500bp 却无条带
我以为是我外源片段量不够染得不明显，就选了2个去测序
结果全不是我要的
现在重新连一次再试试
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4楼2011-07-21 11:06:07
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
其实不蓝白斑筛选挑到阳性克隆的几率还是很大的。
进行菌液PCR鉴定要做阴性和阳性对照，一般来说，菌液PCR跑胶的带像阳性的带那样亮，才能考虑是阳性。然后提质粒做下双酶切，就更加确定了
赞一下(1人) 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2011-07-21 12:04:26
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