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犹寒

铁虫 (初入文坛)

[交流] TA克隆 已有4人参与

请问:
     我用takara的试剂盒做克隆,目的片段是PCR割胶回收的片段,长度从300bp-700bp都有,但是连接出来的蓝白筛选很好,有很多白斑,但是,送去测序后,测出来好多的空质粒,不知道是什么原因,如果是没连上,那应该是蓝斑才对啊,为什么那么多白斑都是质粒呢?
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 说得很好! 2011-07-21 11:27:29
你可以控制一下检查的时间,最好是16小时以内,时间长了,氨苄降解到不能抑制未转化菌生长,可能会挑到没有质粒的菌;至于假阳性,也可能是你的X-GAL涂的不好,不行你就直接加到培养基里吧;另外,你挑的阳性克隆可以先提一下质粒,看一下有没有质粒变长再送去测序
2楼2011-07-21 10:32:56
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healerly

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励交流!一般都是检验过有外源片段连进去再测序呢。 2011-07-21 11:28:05
本帖内容被屏蔽

3楼2011-07-21 10:48:46
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小米饭

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
最近我也有这样的情况发生 蓝白斑很明显 挑的白斑若干
双酶切检验只有载体条带 外源片段在500bp 却无条带
我以为是我外源片段量不够染得不明显,就选了2个去测序
结果全不是我要的
现在重新连一次再试试
4楼2011-07-21 11:06:07
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sxxuan

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
其实不蓝白斑筛选挑到阳性克隆的几率还是很大的。
进行菌液PCR鉴定要做阴性和阳性对照,一般来说,菌液PCR跑胶的带像阳性的带那样亮,才能考虑是阳性。然后提质粒做下双酶切,就更加确定了
你的日子如何,你的力量也必如何!
5楼2011-07-21 12:04:26
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