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sweetcrystal

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhougama at 2011-07-06 17:33:22:
dNTP的浓度没有问题吧，我买的试剂都是100mM的浓度。一般是要求终浓度为200uM，但是因为不可能去那么去取0.1ul或者是更少，所以选择去1ul，这个应该不会影响很大吧。

不是我说你，100mM的不会稀释到10mM的啊，0.1到1是十倍的差距，一般普通PCR的dNTPs浓度0.3mM就足够了，你这体系里都5mM的了，你说有问题不
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11楼2011-07-06 21:45:40
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zhougama

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
12楼2011-07-06 23:11:50
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amilie030312

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sweetcrystal at 2011-07-06 21:45:40:
不是我说你，100mM的不会稀释到10mM的啊，0.1到1是十倍的差距，一般普通PCR的dNTPs浓度0.3mM就足够了，你这体系里都5mM的了，你说有问题不

呵呵，这个好像以前我一个师兄说话的口气啊，好怀念啊。
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13楼2011-07-06 23:41:24
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhougama at 2011-07-06 23:11:50:
你说的有道理哦，以前一直没有想到这点，明天稀释之后再PCR试试，谢谢你啦！

楼主问题解决了么
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14楼2011-07-07 12:42:15
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zhougama

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
15楼2011-07-07 19:43:21
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

zhougama(金币+10): 受教了，谢谢！ 2011-07-08 09:47:15
引用回帖:
Originally posted by zhougama at 2011-07-06 17:34:48:
请问下，什么是touchdown？我的这个反应温度应该没有什么问题，因为同一个程序，做PCR Mix的就能P出条带，我个人觉得这个反应的温度等应该不会影响吧。

降落PCR（touch down PCR）：指的是每一个（或n个）循环退火温度逐步降低1度(我这里是降0.5度)，直到达到一个较低的退火温度，该温度称为：“touchdown"退火温度，然后在该温度下继续循环10个左右循环。
退火温度的起始温度高于计算的TM15度左右（我觉得高于10度也可，比如常归退火温度为57度，我喜欢62度开始循环，每个循环降0.5度，然后9或10个循环后以57对开始正常退火延伸），在接下来的循环中，退火温度每个循环降低1－2度（一般为1度），直到低于TM5度。
该策略的目的在于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异行扩增的反应物之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。
该方法主要用于避免非特异性PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异性退火易发生时。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
16楼2011-07-08 08:45:39
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