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zhougama

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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

zhougama(金币+3): 2011-07-07 09:01:30
zhougama(金币+1): 2011-07-07 12:40:41
做一个touchdown吧。你没给反应温度,这个很重要:)
寝室楼的大爷、大妈都是哲学家,他们每天都在思考人类最根本的三个问题:你是谁?你从哪儿来?要去哪儿?
5楼2011-07-06 16:45:06
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

zhougama(金币+10): 受教了,谢谢! 2011-07-08 09:47:15
引用回帖:
Originally posted by zhougama at 2011-07-06 17:34:48:
请问下,什么是touchdown?我的这个反应温度应该没有什么问题,因为同一个程序,做PCR Mix的就能P出条带,我个人觉得这个反应的温度等应该不会影响吧。

降落PCR(touch down PCR):指的是每一个(或n个)循环退火温度逐步降低1度(我这里是降0.5度),直到达到一个较低的退火温度,该温度称为:“touchdown"退火温度,然后在该温度下继续循环10个左右循环。
退火温度的起始温度高于计算的TM15度左右(我觉得高于10度也可,比如常归退火温度为57度,我喜欢62度开始循环,每个循环降0.5度,然后9或10个循环后以57对开始正常退火延伸),在接下来的循环中,退火温度每个循环降低1-2度(一般为1度),直到低于TM5度。
该策略的目的在于确保第一个引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,即特异行扩增的反应物之间,当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时,特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势,在剩余的反应中,特异产物会竞争非特异产物,特异产物始终优先扩增,从而产生单一的占主导地位的扩增产物。
该方法主要用于避免非特异性PCR产物的出现,尤其是当使用复杂的基因组DNA模板,非特异性退火易发生时。
寝室楼的大爷、大妈都是哲学家,他们每天都在思考人类最根本的三个问题:你是谁?你从哪儿来?要去哪儿?
16楼2011-07-08 08:45:39
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