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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR 扩全长
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5, EPI+1): 对照不可少 2011-07-07 17:30:26
之前我也有一个没有扩出来，那个很变态的。开始区GC含量很高，几乎就没什么AT。两个月没弄出来跟老师说了就换其他的了，别的扩了一次就扩出来了。其实说实话，扩不出来就是扩不出来，一般引物温度什么的问题都不是很大，RNA质量啊当然有关系，不过现在试剂盒什么的都应该很好用了，你问师兄师姐要点cDNA不同的扩一下，Actin也扩一下，再扩不出来就不是你的问题了。扩不出来很正常的。
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11楼2011-06-24 14:28:45
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rb at 2011-06-23 23:16:15:
反转录试剂盒是哪家的？千万不要是takara，takara定量pcr的是短片段的。很多没有详细说明的反转录试剂盒供定量PCR使用的是很难得到全长产物的。我4年前吃过这个亏的。

我用的是invitrogen的反转录试剂盒，我把800BP的条带去测序了，发现不是我的全长，不知道问题出在哪里了
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12楼2011-07-06 16:23:18
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-07-07 17:30:45
引用回帖:
Originally posted by lidongqiao at 2011-07-06 16:23:18:
我用的是invitrogen的反转录试剂盒，我把800BP的条带去测序了，发现不是我的全长，不知道问题出在哪里了

你可以用一下特定引物的rt（针对你的基因设计反转录引物），然后用高保真酶在做PCR，我当年喜欢用 Advantage® 2 DNA Polymerase Mix ，效果很理想。你可以试试。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
13楼2011-07-06 16:42:21
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mengmenglu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 可行 2011-07-07 17:31:05
这个，你才三个月，所以继续吧，我是扩了快一年才出来！你试一下梯度，找出最适的温度吧！
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14楼2011-07-07 15:44:27
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feirlu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:04:46
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:05:07
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:05:26
引用回帖:
14楼: Originally posted by mengmenglu at 2011-07-07 15:44:27:
这个，你才三个月，所以继续吧，我是扩了快一年才出来！你试一下梯度，找出最适的温度吧！

不是吧？一年？我跟楼主有同样情况，cox亚基1一扩就扩出来了，亚基2跟亚基3到现在都很离谱，扩出来2次，但再在扩出来的温度条件下扩，就什么都没有，touchdown pcr也试过了，没个反应的都，扩出来过肯定不是引物问题，模板已经用其它引物确定没问题，请教下该如何改进呢？
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15楼2011-09-08 16:51:16
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feirlu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

看天: 这个不算应助 2011-09-08 17:07:18
楼主现在扩增的怎么了？我的情况也类似啊。。。
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16楼2011-09-08 16:52:25
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临风7071

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-09-17 13:17:09
楼主，你看看是不是你的GC含量很高的啊？
实在不行，你就分段扩，在连起来
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17楼2011-09-17 10:27:54
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-17 13:16:08
高GC含量的PCR可以加入一些甜菜碱或者甘油，不知道楼主的Marker使用的是哪的，貌似今天刚听师兄说天根的marker不准。还有，上样孔有亮点我觉得除了样品不纯没有其他解释吧，如果你减少胶浓度，还有亮点的话，我觉得只能说明是有蛋白污染了。
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18楼2011-09-17 11:40:55
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spiderboy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以尝试把全长分两段扩，然后再把两段连起来，这样比较容易，而且碱基变异的概率低。
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19楼2011-09-17 13:33:19
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320080920001

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

19楼说的很对啊，我之前去过的实验室用LIC系统，可以最多把7段片段连起来，效率很高啊。
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20楼2011-09-18 10:30:50
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