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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR 扩全长
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR 扩全长

各位高手，我现在在扩基因全长，扩了3个月了，一点结果也没有。具体情况是跑电泳结果是点样孔处有亮带，其他什么都没有，开始我认为是不是当时提的RNA不纯，里面还有蛋白质或DNA，所以又重新提了一次，结果还是这个样子。
序列1的5端到3端sense primer:ATGGAGGTACAGAGAGTTCAAG
            5端到3端antisense primer:TCACTGTGGAAGCTTGTTTAAC
序列2的5端到3端sense primer:ATGGTTCAAGCAGAAATGGT
             5端到3端antisense primer:TTACACGGTTAAGTTCCTGGT
退火温度从65到53都试过了，也还是不行：也用过touchdown好多次，还是不行，怎么解决呢
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1楼 2011-06-15 16:38:30
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feirlu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:04:46
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:05:07
看天(金币+4): 新人鼓励 常来 2011-09-08 17:05:26
引用回帖:
14楼: Originally posted by mengmenglu at 2011-07-07 15:44:27:
这个，你才三个月，所以继续吧，我是扩了快一年才出来！你试一下梯度，找出最适的温度吧！

不是吧？一年？我跟楼主有同样情况，cox亚基1一扩就扩出来了，亚基2跟亚基3到现在都很离谱，扩出来2次，但再在扩出来的温度条件下扩，就什么都没有，touchdown pcr也试过了，没个反应的都，扩出来过肯定不是引物问题，模板已经用其它引物确定没问题，请教下该如何改进呢？
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15楼2011-09-08 16:51:16
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love_st

金虫 (著名写手)
★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-15 19:33:00
帮你看了下第一对的上下游引物，下游引物二聚体稍微有点大，引物之间的二聚体也稍微有点，不过应该影响不大的，你应该再提供下其它的信息
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2楼2011-06-15 16:50:35
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-15 19:33:06
才提几次RNA  提了十次再来说技术问题。 实验就是熟能生巧。  我认为你的问题是RNA的纯度。以及后续反转cDNA的问题。和引物关系不大
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3楼2011-06-15 17:42:39
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
★ ★
silicare(金币+2): 鼓励交流 2011-07-07 17:28:58
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-06-15 16:50:35:
帮你看了下第一对的上下游引物，下游引物二聚体稍微有点大，引物之间的二聚体也稍微有点，不过应该影响不大的，你应该再提供下其它的信息

谢谢，我扩的全长是1000多bp，第一对引物，软件上给的上游的退火温度是52.9，下游是55度，送到生工去合成后，反馈回来写的第一对引物上游是58.21度，下游是56.35，第二对引物，软件上给的上游的退火温度是54.5，下游是53.7度，送到生工去合成后，反馈回来写的第一对引物上游是54.4度，下游是56.06，你看按哪个说的好些？是软件上的还是合成后订单上给的呀
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4楼2011-06-15 19:07:14
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