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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR 扩全长
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR 扩全长

各位高手，我现在在扩基因全长，扩了3个月了，一点结果也没有。具体情况是跑电泳结果是点样孔处有亮带，其他什么都没有，开始我认为是不是当时提的RNA不纯，里面还有蛋白质或DNA，所以又重新提了一次，结果还是这个样子。
序列1的5端到3端sense primer:ATGGAGGTACAGAGAGTTCAAG
            5端到3端antisense primer:TCACTGTGGAAGCTTGTTTAAC
序列2的5端到3端sense primer:ATGGTTCAAGCAGAAATGGT
             5端到3端antisense primer:TTACACGGTTAAGTTCCTGGT
退火温度从65到53都试过了，也还是不行：也用过touchdown好多次，还是不行，怎么解决呢
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1楼 2011-06-15 16:38:30
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-07-07 17:29:53
反转录试剂盒是哪家的？千万不要是takara，takara定量pcr的是短片段的。很多没有详细说明的反转录试剂盒供定量PCR使用的是很难得到全长产物的。我4年前吃过这个亏的。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
10楼2011-06-23 23:16:15
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普通回帖

love_st

金虫 (著名写手)
★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-15 19:33:00
帮你看了下第一对的上下游引物，下游引物二聚体稍微有点大，引物之间的二聚体也稍微有点，不过应该影响不大的，你应该再提供下其它的信息
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2楼2011-06-15 16:50:35
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-06-15 19:33:06
才提几次RNA  提了十次再来说技术问题。 实验就是熟能生巧。  我认为你的问题是RNA的纯度。以及后续反转cDNA的问题。和引物关系不大
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3楼2011-06-15 17:42:39
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
★ ★
silicare(金币+2): 鼓励交流 2011-07-07 17:28:58
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-06-15 16:50:35:
帮你看了下第一对的上下游引物，下游引物二聚体稍微有点大，引物之间的二聚体也稍微有点，不过应该影响不大的，你应该再提供下其它的信息

谢谢，我扩的全长是1000多bp，第一对引物，软件上给的上游的退火温度是52.9，下游是55度，送到生工去合成后，反馈回来写的第一对引物上游是58.21度，下游是56.35，第二对引物，软件上给的上游的退火温度是54.5，下游是53.7度，送到生工去合成后，反馈回来写的第一对引物上游是54.4度，下游是56.06，你看按哪个说的好些？是软件上的还是合成后订单上给的呀
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4楼2011-06-15 19:07:14
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
silicare: 上图看看 2011-07-07 17:29:27
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2011-06-15 17:42:39:
才提几次RNA  提了十次再来说技术问题。 实验就是熟能生巧。  我认为你的问题是RNA的纯度。以及后续反转cDNA的问题。和引物关系不大

我提完RNA跑完电泳，电泳有清晰的两条带，也测完浓度，纯度为147ng/ul，反转cDNA后还测了第一链的浓度，为1000ng/ul,逆转了3次PCR后都是这个情况
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5楼2011-06-15 19:11:01
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lidongqiao at 2011-06-15 19:07:14:
谢谢，我扩的全长是1000多bp，第一对引物，软件上给的上游的退火温度是52.9，下游是55度，送到生工去合成后，反馈回来写的第一对引物上游是58.21度，下游是56.35，第二对引物，软件上给的上游的退火温度是54.5 ...

你这个引物用60度一点问题都没有，从oligo看62度左右
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lidongqiao
6楼2011-06-15 21:10:16
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lidongqiao(金币+1): 2011-06-23 15:48:03
引用回帖:
Originally posted by lidongqiao at 2011-06-15 19:11:01:
我提完RNA跑完电泳，电泳有清晰的两条带，也测完浓度，纯度为147ng/ul，反转cDNA后还测了第一链的浓度，为1000ng/ul,逆转了3次PCR后都是这个情况

你这两对引物是哪里来的。。 自己设计的还是文献给的。 没有用内参先尝试一下么。。。
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7楼2011-06-15 21:30:26
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-06-15 21:10:16:
你这个引物用60度一点问题都没有，从oligo看62度左右

谢谢，我试试
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8楼2011-06-23 09:06:50
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lidongqiao

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2011-06-15 21:30:26:
你这两对引物是哪里来的。。 自己设计的还是文献给的。 没有用内参先尝试一下么。。。

我是自己设计的，根据premier primer  5 设计的，oligo评价的，来的，现在第二对引物在退火温度是68度时扩出来了800bp左右，但实际应当是1100左右，可是800bp的条带特别清晰，并且很亮，现在不知道怎么处理好，800bp的应当不是吧
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9楼2011-06-23 15:50:46
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