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p120933799金虫 (小有名气)
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[求助]
DNA溶解小问
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| 我用CTAB方法提取真菌DNA，基本上是严格按照操作，可最后加TE后总有不溶解透明物质，在65℃下也不溶解，请问为何？如何可避免，以往也遇到很多这种情况， |
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【答案】应助回帖
p120933799(金币+5): 谢谢，很详细啊 2011-06-14 08:41:41
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采用冷冻研磨CTAB法提取样品基因组DNA。 （1）从斜面培养基中接入一定量的孢子至液体种子培养基中180rpm，28℃培养2天，用7mL的离心管离心收集菌体，用无菌水洗涤后充分晾干至-70℃冰箱保存。 （2）取0.5g干燥的菌丝体放入研钵中，用液氮磨碎至粉状，转移至7mLeppendorf离心管中。 （3）加入2mL 65℃预热的2×CTAB 抽提液，颠倒混匀，65℃保温30min，每隔数分钟温和混匀一次。 （4）加入2mL的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，室温静置5～10min ，10000rpm离心5min。 （5）取上清约2mL转至另一干净的eppendorf离心管中（注意不要吸出有机相），加入200uL 65℃预热的CTAB/ NaCl 溶液，轻缓颠倒混匀。 （6）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提液，混匀，10000rpm离心5min。 （7）取上清700uL至另一干净的eppendorf离心管中（注意不要吸出有机相），加入等体积的 CTAB沉淀液，颠倒混匀，65℃保温30min。 （8）4℃，5000rpm离心5min。 （9）倒去上清，用滤纸吸干残液，加入500uL 高盐TE缓冲液重悬沉淀，65℃保温30min，直至完全溶解。 （10）加入300 uL的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4℃，10000rpm离心15min。 （11）倒去上清，用80%乙醇洗涤沉淀，用滤纸吸干残液，在超净工作台中室温下自然干燥。 （12）加入100uL含RNA酶的TE缓冲液重悬，42℃水浴30min。 以0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释100倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/ OD280的比值） 这是我做的步骤，溶解不了是不是最后搞的太干了~这种情况应该是很少的~ |
2楼2011-06-13 19:20:52
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
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CTAB法太繁琐了，看我的 2.4.14.1真菌总DNA的提取 （1）接种菌株至液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3天； （2）用灭菌纱布过滤，并压干菌体； （3）将菌丝体倒入研钵（灭菌并预冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末状； （4）将粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液； （5）加等体积苯酚/氯仿，轻轻倒转混合，10000rpm离心10min； （6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重复步骤（5）； （7）取上清液，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放置30min； （8）10000rpm 离心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥； （9）以20µL 1×TE 溶解沉淀； （10）电泳检测总DNA的浓度。 （5）DNA抽提液的配置 表 2.5 DNA抽提液的配置 成分 浓度 NaCl 200mmol/L EDTA-Na2 4mmol/L SDS 2% Tris-HCl(pH=8.0) 100mmol/L |
3楼2011-06-14 21:33:42