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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB定量问题
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chunmeiyang

银虫 (正式写手)

[求助] WB定量问题

请问大家， WB是可以定量的吗 怎么定量啊？
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1楼 2011-06-06 14:08:10
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

【答案】应助回帖

chunmeiyang(金币+2): 2011-06-07 08:56:57
silicare: 谢谢，不过楼主的意思是WB定量，而不是蛋白定量方法 2011-06-07 18:23:56
蛋白含量的测定
（一） 制作标准曲线
1、从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
3、按下表在各管中加入各种试剂。
        0μg        2.5μg        5.0μg        10.0μg        20.0μg        40.0μg
1mg/ml BSA        －        2.5μl        5.0μl        10.0μl        20.0μl        40.0μl
0.15mol/L NaCl        100μl        97.5μl        95.0μl        90.0μl        80.0μl        60.0μl
G250考马斯亮蓝溶液        1ml        1ml        1ml        1ml        1ml        1ml
4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。
（二） 检测样品蛋白含量
1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5μl样品含的蛋白量。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA                0.1g
0.15 mol/L NaCl    1ml
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。

我们得到标准曲线方程：y=0.02x+0.089(y代表OD600吸光值, x代表蛋白浓度ug/ul)
祝你好运！！这个方法还是很好用的。
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梦在路就在！
2楼2011-06-06 17:10:01
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫

【答案】应助回帖

chunmeiyang(金币+1): 2011-06-07 08:59:46
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-06-06 17:10:01:
蛋白含量的测定
（一） 制作标准曲线
1、从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
3、按下表在各管中加 ...

G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）

考马斯亮蓝G250     100mg
95％乙醇            50ml
磷酸                100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。


0.15 mol/L NaCl

NaCl（MW58.44）   0.877g
蒸馏水至          100 ml
高温灭菌后，室温保存。
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梦在路就在！
3楼2011-06-06 17:13:53
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
回答非常专业，想楼主应该是满意了。
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4楼2011-06-06 17:44:48
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

chunmeiyang(金币+1): 2011-06-07 08:59:57
楼主问的是WB定量，不是蛋白定量吧？
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jiayoubashaonian
5楼2011-06-06 19:57:22
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2011-06-06 19:57:22:
楼主问的是WB定量，不是蛋白定量吧？

WB到底指什么呀？
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6楼2011-06-07 04:32:57
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chunmeiyang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-06-06 17:10:01:
蛋白含量的测定
（一） 制作标准曲线
1、从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
3、按下表在各管中加 ...

谢谢你这么详尽的回答！  收益不少！其实我想问的是WB显影出来后  那个条带是如何定量的？
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7楼2011-06-07 08:58:35
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chunmeiyang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-06-07 04:32:57:
WB到底指什么呀？

western blot
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8楼2011-06-07 09:00:21
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chunmeiyang

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2011-06-06 19:57:22:
楼主问的是WB定量，不是蛋白定量吧？

是的
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9楼2011-06-07 09:00:51
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 正解 2011-06-07 18:24:28
那个做相对定量吧，就是看看各个条带的亮度，用quantity one就可以，其它类似的也行
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10楼2011-06-07 10:27:11
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