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jayxj铁杆木虫 (小有名气)
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pMG36e 构建的奇怪现象
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质粒构建在我们实验室已是常规操作，但是最近构建pMG36e时出现一个奇怪的问题： 转化后，在红霉素（200ug/ml）筛选LB培养基上，要么没有菌落，要么长出的菌落扩大后提不出质粒。（菌体抗药性突变？也太频繁了吧？几十个克隆都这样） 请各位帮忙分析下原因。 目的基因长度：1000~2000bp（几个基因）此载体也曾连上过300bp和2500bp的片段。 酶切位点：SacI和HindIII 感受态：全式金DH5a、自制高效感受态，已验证 质粒提取试剂盒：生工和鼎国小提试剂盒，已验证 连接酶：TaKaRa Solution I 和 T4连接酶，已验证 连接接比例：质粒:目的基因=1:4~1:10 连接时间：12~16小时 以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题。 |
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【答案】应助回帖
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amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:29
jayxj(金币+5): 非常感谢 2011-05-25 16:16:54
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:29
jayxj(金币+5): 非常感谢 2011-05-25 16:16:54
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其实个人觉得楼主说的：以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题；给这些载体克隆基因没有问题并不见得给你的那个载体克隆也没有问题嘛，这不问题出现了吗？ 克隆一个基因其实个人觉得关键在于连接和感受态细胞。。。按照你上面所述，连接体系应该也不会出现什么问题，连接时间可以稍微短一些，7小时---10小时试试。。。 另外抗生素有没有问题呢？浓度会不会太大了？ 你的载体和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也会影响你后期的连接的。。。 可以变换体系再试试。。。 |
2楼2011-05-24 19:54:46
jayxj
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3楼2011-05-25 16:15:31
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4楼2011-05-25 16:23:06
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