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该死的玻璃杯

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么DNA提取总降解

目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮,看不到DNA条带或者带很弱。样品提取之后曾使用RNase进行处理、使用常规方法提取后过柱子回收DNA、在提取过程中在CTAB温育之前进行RNase的处理等。该DNA样品含有很多RNA,需要处理掉RNA,但是其DNA对酶极其敏感,甚至沸水处理了半小时的RNase溶液加入样品中也可以造成DNA的降解,包括过柱子的方法也造成DNA的降解。

说明:该菌含多糖较多,生长缓慢

请高人指教!
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.你菌体破碎的不是很彻底,好多DNA没有释放出来。
2.破碎的时候加入RNA酶
3.温育或沸水育时间太长了,56度或65度5-10min即可。
14楼2012-11-26 11:48:39
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追远0102

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮 ...

开学再读研,顶起,我也想知道
逐步适应
2楼2011-05-18 11:18:17
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good! 2011-05-18 11:38:19
引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮 ...

用TE溶解,本来就看不到DNA吧,你跑胶都看不到DNA,那你会不会是本来就没有DNA呢?
液氮研磨之后,用TE溶解,然后离心沉淀,去上清,用乙醇沉淀,再把沉淀跑电泳看有没有,之后再优化
3楼2011-05-18 11:23:36
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springTT

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


1949stone(金币+1): 鼓励 2011-05-18 14:39:16
我们实验室用玻璃珠法提真菌DNA,效果还不错。整个过程没有用到TE溶液,在最后加入RNase 37℃消化1h。
4楼2011-05-18 11:55:07
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