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yangru.520

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助】小麦籽粒中蔗糖-淀粉转化过程中关键酶活性测定

请问有没有哪位做过小麦籽粒中蔗糖-淀粉转化过程中关键酶（SS、SPS、ADPG-PPase、UDPG-PPase、SSS、GBSS）活性的测定。求方法。

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1楼2011-04-06 22:38:40

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大田实验在开花期挂牌标记生长一致且同日开花的麦穗，花后每隔5天取样，每次15穗，取其剑叶和籽粒，经液氮速冻后，置于-40℃冰箱保存，用于腺苷二磷酸葡糖糖焦磷酸化酶（AGPP）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、束缚态淀粉合成酶（GBSS）的测定。另取15穗，分离籽粒置于烘箱中105℃杀青30min，然后80℃烘干称重，籽粒经微型高速万能粉碎机粉碎后，用于蔗糖、可溶性总糖、淀粉及其组分含量的测定。
蔗糖含量的测定采用间苯二酚法，可溶性总糖含量的测定采用蒽酮比色法。
取20个籽粒，加4ml提取液（含100mmol/L Tricine—NaOH（PH=7.5），8mmol/LMgCl2，2mmol/LEDTA，12.5%（V/V）甘油，1%（W/V）PVP—40，50mmol/L2—巯基乙醇），磨成匀浆，在10000×g离心30min，然后收集上清液置于冰浴，作为粗酶液备用。沉淀用1ml提取液洗涤两次，然后悬浮于2ml的提取介质中，用与GBSS活性测定。
AGPP活性测定：取20µl酶粗提取加入110µl反应液中（反应液最终浓度是100mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、1.2mmol/LADPG，3mmol/LPPi，5mmol/L MgCl2，4mmol/LDTT），30℃反应20min后，沸水中终止反应30s，10000×g，10min，取上清液100µl加5.2µl比色液（5.76mmol/LNADP，0.08unitP—glucomutase（磷酸葡萄糖变位酶），0.07unitG6P—脱氢酶）。30℃反应10min后，测定340nmOD值。根据OD值的增加量计算ADPG焦磷酸化酶的活力，单位为nmol/1000seeds min，以20µl煮沸的粗酶液作为对照。
SSS、GBSS活性的测定：取20µl酶粗提取液加入36µl反应液Ⅰ（反应液最终浓度为50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、1.6mmol/LADPG、0.7mg支链淀粉、15mmol/LDTT），30℃反应20min后，沸水中终止反应30s，冰浴中冷却；加20µl反应液Ⅱ（含50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、4mmol/LPEP、200mmol/LKCl、10mmol/LMgCl2、1.2unit丙酮酸激酶），30℃反应20min后，沸水中终止反应30s，10000×g离心10min。取上清液60µl与43µl反应液Ⅲ（50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、10mmol/L葡萄糖、20mM MgCl2、2mmol/LNADP、1.4unit己糖激酶、0.35unit G6P—脱氢酶），30℃反应10min后，测定340nmOD值的变化，单位为nmol/1000seeds min，以20µl煮沸的粗酶液作为对照。

希望对你有所帮助，呵呵