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yangru.520

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助】小麦籽粒中蔗糖-淀粉转化过程中关键酶活性测定

请问有没有哪位做过小麦籽粒中蔗糖-淀粉转化过程中关键酶(SS、SPS、ADPG-PPase、UDPG-PPase、SSS、GBSS)活性的测定。 求方法。
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laoganbu33

木虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
大田实验在开花期挂牌标记生长一致且同日开花的麦穗,花后每隔5天取样,每次15穗,取其剑叶和籽粒,经液氮速冻后,置于-40℃冰箱保存,用于腺苷二磷酸葡糖糖焦磷酸化酶(AGPP)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、束缚态淀粉合成酶(GBSS)的测定。另取15穗,分离籽粒置于烘箱中105℃杀青30min,然后80℃烘干称重,籽粒经微型高速万能粉碎机粉碎后,用于蔗糖、可溶性总糖、淀粉及其组分含量的测定。
蔗糖含量的测定采用间苯二酚法,可溶性总糖含量的测定采用蒽酮比色法。
取20个籽粒,加4ml提取液(含100mmol/L Tricine—NaOH(PH=7.5),8mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA,12.5%(V/V)甘油,1%(W/V)PVP—40,50mmol/L2—巯基乙醇),磨成匀浆,在10000×g离心30min,然后收集上清液置于冰浴,作为粗酶液备用。沉淀用1ml提取液洗涤两次,然后悬浮于2ml的提取介质中,用与GBSS活性测定。
AGPP活性测定:取20µl酶粗提取加入110µl反应液中(反应液最终浓度是100mmol/LHEPES—NaOH(PH=7.4)、1.2mmol/LADPG,3mmol/LPPi,5mmol/L MgCl2,4mmol/LDTT),30℃反应20min后,沸水中终止反应30s,10000×g,10min,取上清液100µl加5.2µl比色液(5.76mmol/LNADP,0.08unitP—glucomutase(磷酸葡萄糖变位酶),0.07unitG6P—脱氢酶)。30℃反应10min后,测定340nmOD值。根据OD值的增加量计算ADPG焦磷酸化酶的活力,单位为nmol/1000seeds min,以20µl煮沸的粗酶液作为对照。
SSS、GBSS活性的测定:取20µl酶粗提取液加入36µl反应液Ⅰ(反应液最终浓度为50mmol/LHEPES—NaOH(PH=7.4)、1.6mmol/LADPG、0.7mg支链淀粉、15mmol/LDTT),30℃反应20min后,沸水中终止反应30s,冰浴中冷却;加20µl反应液Ⅱ(含50mmol/LHEPES—NaOH(PH=7.4)、4mmol/LPEP、200mmol/LKCl、10mmol/LMgCl2、1.2unit丙酮酸激酶),30℃反应20min后,沸水中终止反应30s,10000×g离心10min。取上清液60µl与43µl反应液Ⅲ(50mmol/LHEPES—NaOH(PH=7.4)、10mmol/L葡萄糖、20mM MgCl2、2mmol/LNADP、1.4unit己糖激酶、0.35unit G6P—脱氢酶),30℃反应10min后,测定340nmOD值的变化,单位为nmol/1000seeds min,以20µl煮沸的粗酶液作为对照。


希望对你有所帮助,呵呵
11楼2011-12-04 16:22:09
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青岛一逍遥

木虫 (正式写手)


yangru.520(金币+2): 2011-04-07 15:56:52
这些指标很费钱的说

我这有部分方法~~
2楼2011-04-07 14:47:57
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tjshan1983

银虫 (正式写手)


yangru.520(金币+2): 2011-04-07 16:37:13
SS、SPS可参考中国科学院上海植物生理研究所, 上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南. 北京: 科学出版社. 1999
3楼2011-04-07 16:08:15
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yangru.520

木虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yangru.520 at 2011-04-06 22:38:40:
请问有没有哪位做过小麦籽粒中蔗糖-淀粉转化过程中关键酶(SS、SPS、ADPG-PPase、UDPG-PPase、SSS、GBSS)活性的测定。 求方法。

我的邮箱是yangru.520@163.com,能否将相关方法发到我的邮箱里。希望以后有机会能和您多多交流!
4楼2011-04-07 16:34:58
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