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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】质粒的单链处理
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由田120516

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】质粒的单链处理

有没有做过基因敲除的朋友，在处理自杀质粒时用过这个方法：取2ug自杀质粒溶于20uL0.2mo1/L NaOH溶液中(含0.2mmo1/L,EDTA),  37度孵育30min。加入2ul乙酸钠(3mo1/L,  PH 4.8),  80ul无水乙醇，-70 度沉淀质粒DNA,  70%乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥。而后溶于10ul灭菌去离子水中，冰浴2小时，-20 度保存备用。
如果有，我想请教一下，在用NaOH处理后，是否需要离心收集沉淀，再加乙酸钠，还是不离心，直接加？谢谢
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1楼 2011-03-31 08:53:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
一般加乙酸钠的体积是1/10，你这个protocol 恰好也是1/10.
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2楼2011-03-31 09:05:36
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-31 09:05:36:
一般加乙酸钠的体积是1/10，你这个protocol 恰好也是1/10.

朋友，我知道要加乙酸钠，你再看看问题，我问的不是加不加，而是怎么加
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3楼2011-03-31 09:25:09
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-03-31 09:25:09:
朋友，我知道要加乙酸钠，你再看看问题，我问的不是加不加，而是怎么加

1/10体积加当然是不离心啊。
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4楼2011-03-31 09:40:38
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-31 09:40:38:
1/10体积加当然是不离心啊。

那我能得到单链质粒吗？酸和碱中和，不就使质粒复性了吗？
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5楼2011-03-31 10:10:44
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
由田120516(金币+1): 2011-03-31 11:04:35
由田120516(金币+9): 2011-03-31 11:05:14
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-03-31 10:10:44:
那我能得到单链质粒吗？酸和碱中和，不就使质粒复性了吗？

呵呵，你多虑了。测序时制备单链DNA就是这么干的。
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6楼2011-03-31 10:33:46
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