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1 细胞培养及分组 MCM4201完全培养基常规培养HMCs，置于37℃、饱和湿度5%CO2的孵箱内贴壁传代培养，隔日换液,0.25%胰酶3~4天消化、传代。取6~9代对数生长期细胞，以每孔3~5×105个细胞接种6孔板中，培养细胞待其贴壁融合70%~80%后用无血清Opti-MEM培养基同步化24h，用于RNA转染及不同环境下继续培养。 2、siRNA合成与转染 根据GenBank数据库提供的人SAA全长基因(GenBank Acc. No. NM_001664.2)由美国Invitrogen公司设计合成RNAi的siRNA，SAA-siRNA：5′-GCUCAGACAAAUACUUCCAUGCUCG-3′；HMCs共分7组：（1）正常对照组（NG，含葡萄糖5.5mmol/L）；（2）高糖组（HG，含葡萄糖30mmol/L）；(3)等渗对照组（Man+ NG，含5.5mM葡萄糖及24.5mM的甘露醇）；(4) 波动糖组（FG, 含葡萄糖30mmol/L与含葡萄糖5.5mmol/L MCM培养基每4小时交替培养）；（5）高糖+脂质体对照组（HG+Lipo）；（6）高糖+阴性转染对照组（HG+negative-siRNA）；(7) 高糖+SAA-siRNA组（HG+SAA-siRNA）。以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记的siRNA做对照，转染48h后在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达，计算转染效率。脂质体瞬时转染方法严格按照Lipofectamine?2000说明书进行。于0h、12h、24h、48h末收集各组细胞上清。 3 、总RNA提取及cDNA的合成 各组分别作用48h后按5×106～1×107个细胞加1ml TRIzol低温吹打，后续操作按Trizol说明书进行，最后用DEPC处理的超纯水溶解RNA，60℃孵育5 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，分光光度计测定其纯度和浓度。cDNA合成的反应体系按照试剂盒进行：① 5×PrimeScriptTM Buffer（for Real Time） 4 μl; ② PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1μl;③ Oligo dT Primer（50 μM）1μl;④Random 6 mers（100 μM）1μl;⑤ Total RNA 1μg;⑥ 加RNase Free dH2O至20μl反应体系。反转录反应条件：37℃，15min；85℃，15s反转录成cDNA。 4 、实时定量PCR 采用SYBRGreen嵌合荧光进行反应，按说明书配制25μl的反应体系，①SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×）12.5 μl；②PCR Forward Primer（10 μM）1μl；③PCR Reverse Primer（10 μM）1μl； ④模板（cDNA溶液）2μl；⑤dH2O 8.5 μl。阴性对照组加入未反转录的RNA作为模板。上下游引物均由大连宝生物工程有限公司（Takara）设计合成(表1)，反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，58~62℃退火20s，72℃延伸30s同时获取荧光，共40个循环，后行产物的溶解曲线分析, 得到样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-ΔΔCt 表示基因的相对表达量，ΔΔCt=[Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)]试验组-[Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)]对照组。 5 、ELISA法检测细胞上清液中FN、SAA、TNF蛋白的含量 取不同处理因素作用0h、12h、24h、48h的细胞上清液，无菌管收集，6000转，4℃，离心10分钟，仔细收集上清，后续操作按ELISA试剂盒说明书进行，在酶标仪450nm波长处，以空白对照孔调零，直接测定吸光值，并由标准曲线公式换算成各蛋白的浓度值。 6、 数据分析 所有数据以 表示，采用SPSS 17.0统计分析软件，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD, Dunnett’s T3，P＜0.05为差异有统计学意义。 [ Last edited by Mally89 on 2011-4-5 at 15:04 ] |
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 ！已经为中文了，故如下：1 细胞培养及分组 MCM4201完全培养基常规培养HMCs，置于37℃、饱和湿度5%CO2的孵箱内贴壁传代培养，隔日换液,0.25%胰酶3~4天消化、传代。取6~9代对数生长期细胞，以每孔3~5×105个细胞接种6孔板中，培养细胞待其贴壁融合70%~80%后用无血清Opti-MEM培养基同步化24h，用于RNA转染及不同环境下继续培养。 2、siRNA合成与转染 根据GenBank数据库提供的人SAA全长基因(GenBank Acc. No. NM_001664.2)由美国Invitrogen公司设计合成RNAi的siRNA，SAA-siRNA：5′-GCUCAGACAAAUACUUCCAUGCUCG-3′；HMCs共分7组：（1）正常对照组（NG，含葡萄糖5.5mmol/L）；（2）高糖组（HG，含葡萄糖30mmol/L）；(3)等渗对照组（Man+ NG，含5.5mM葡萄糖及24.5mM的甘露醇）；(4) 波动糖组（FG, 含葡萄糖30mmol/L与含葡萄糖5.5mmol/L MCM培养基每4小时交替培养）；（5）高糖+脂质体对照组（HG+Lipo）；（6）高糖+阴性转染对照组（HG+negative-siRNA）；(7) 高糖+SAA-siRNA组（HG+SAA-siRNA）。以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记的siRNA做对照，转染48h后在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达，计算转染效率。脂质体瞬时转染方法严格按照Lipofectamine?2000说明书进行。于0h、12h、24h、48h末收集各组细胞上清。 3 、总RNA提取及cDNA的合成 各组分别作用48h后按5×106～1×107个细胞加1ml TRIzol低温吹打，后续操作按Trizol说明书进行，最后用DEPC处理的超纯水溶解RNA，60℃孵育5 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，分光光度计测定其纯度和浓度。cDNA合成的反应体系按照试剂盒进行：① 5×PrimeScriptTM Buffer（for Real Time） 4 μl; ② PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1μl;③ Oligo dT Primer（50 μM）1μl;④Random 6 mers（100 μM）1μl;⑤ Total RNA 1μg;⑥ 加RNase Free dH2O至20μl反应体系。反转录反应条件：37℃，15min；85℃，15s反转录成cDNA。 4 、实时定量PCR 采用SYBRGreen嵌合荧光进行反应，按说明书配制25μl的反应体系，①SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×）12.5 μl；②PCR Forward Primer（10 μM）1μl；③PCR Reverse Primer（10 μM）1μl； ④模板（cDNA溶液）2μl；⑤dH2O 8.5 μl。阴性对照组加入未反转录的RNA作为模板。上下游引物均由大连宝生物工程有限公司（Takara）设计合成(表1)，反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，58~62℃退火20s，72℃延伸30s同时获取荧光，共40个循环，后行产物的溶解曲线分析, 得到样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-ΔΔCt 表示基因的相对表达量，ΔΔCt=[Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)]试验组-[Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)]对照组。 5 、ELISA法检测细胞上清液中FN、SAA、TNF蛋白的含量 取不同处理因素作用0h、12h、24h、48h的细胞上清液，无菌管收集，6000转，4℃，离心10分钟，仔细收集上清，后续操作按ELISA试剂盒说明书进行，在酶标仪450nm波长处，以空白对照孔调零，直接测定吸光值，并由标准曲线公式换算成各蛋白的浓度值。 6、 数据分析 所有数据以 表示，采用SPSS 17.0统计分析软件，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD, Dunnett’s T3，P＜0.05为差异有统计学意义。 Keywords: 细胞培养 SiRNA PCR |
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