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lhm_hnyj金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】PCR引物二聚体问题 已有5人参与
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急求帮助。下面是我的目的序列： TGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTTTCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCGCCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGGGTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGGGCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGAGTGGTGACTCGATAATG；选用的引物为GTCAAGAAGCAAGCAAAGGAATC与TCAACTGGAGGGTGTGGTGG，在上述序列中已用括号隔开。我的实验目的是同属物种真伪鉴别，用这对引物只有正品获得目的条带，伪品没有，问题是均存在非特异扩增，从电泳图上来看应该是引物二聚体导致的。现在用SYBR实时荧光PCR来定性，实验结果一致，溶解曲线图谱中引物二聚体的峰明显，倒是不影响结果判断。Tm值阴性71.7°，阳性78.3与88.7°；Ct值阴性34，阳性19. 因为用探针法时间来不及，想请教大家，避免引物二聚体我该怎么将现有的引物加以改进呢；还有阴性和阳性非特异扩增的Tm值差异是什么导致的呢。 |
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