【求助/交流】DNA退火 - 分子生物 - 综合其他 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2011-01-10 13:15:01

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wangdandelia

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 13:15:01:

什么叫还不错，几次方？连接片段和空载体是两码事

我用的感受态细胞是DH5a，空载体转化，100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板，没有计数，大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板，长出阳性克隆是50个左右，阴性对照没有长出菌落。
请问连接和转化这些过程中还有没有特别的注意事项呢？昨天晚上听一位师姐说，感受态细胞从-80℃冰箱拿出来立刻用手捂化，然后立刻转化，而且感受态细胞最好用买的，那样转化效率会高一些。可是我们实验室的感受态细胞都是自己做的。

12楼2011-01-10 14:17:46

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silicare

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:17:46:

我用的感受态细胞是DH5a，空载体转化，100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板，没有计数，大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板，长出阳性克隆是50个左右，阴性对照没有长出菌 ...

你还是没有明白转化效率的重要性

空载体做转化没有不长的

13楼2011-01-10 14:22:52

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wangdandelia

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:22:52:

你还是没有明白转化效率的重要性

空载体做转化没有不长的

哦，那我该怎样测量感受态细胞的转化效率呢？

14楼2011-01-10 14:24:25

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:24:25:

哦，那我该怎样测量感受态细胞的转化效率呢？

网上到处都是，百度一下就可以

一般就是转化0.1ng 看看100ul感受态能够长出多少个菌斑，换算成1ug的菌斑数就是转化效率

15楼2011-01-10 14:30:09

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:30:09:

网上到处都是，百度一下就可以

一般就是转化0.1ng 看看100ul感受态能够长出多少个菌斑，换算成1ug的菌斑数就是转化效率

哦，好，请问在转化过程中还需要注意哪些事项呢？

16楼2011-01-10 14:37:51

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:37:51:

哦，好，请问在转化过程中还需要注意哪些事项呢？

低温，轻柔，快速，无菌，一个高效感受态是前提，做连接产物（尤其你这还是退火的）至少也要6次方以上的效率，7次方最佳，8次方必成功

6次方以下就扔了吧

17楼2011-01-10 14:43:01

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:43:01:

低温，轻柔，快速，无菌，一个高效感受态是前提，做连接产物（尤其你这还是退火的）至少也要6次方以上的效率，7次方最佳，8次方必成功

6次方以下就扔了吧

恩，好，真是太感谢你了~请问你用的感受态细胞也都是自己制作的吗？

18楼2011-01-10 14:46:48

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:46:48:

恩，好，真是太感谢你了~请问你用的感受态细胞也都是自己制作的吗？

分子克隆的就很好

19楼2011-01-10 14:49:04

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:49:04:

分子克隆的就很好

分子克隆？什么意思？是分子克隆书上面写的吗？