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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 13:03:29:


恩,谢谢美女,呵呵~我用的是电转化,有两个片段可以连接上,其余的都不能连接,我用空载体转化,效率还不错。。

什么叫还不错,几次方? 连接片段和空载体是两码事
11楼2011-01-10 13:15:01
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 13:15:01:



什么叫还不错,几次方? 连接片段和空载体是两码事

我用的感受态细胞是DH5a,空载体转化,100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板,没有计数,大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板,长出阳性克隆是50个左右,阴性对照没有长出菌落。
请问连接和转化这些过程中还有没有特别的注意事项呢? 昨天晚上听一位师姐说,感受态细胞从-80℃冰箱拿出来立刻用手捂化,然后立刻转化,而且感受态细胞最好用买的,那样转化效率会高一些。可是我们实验室的感受态细胞都是自己做的。
12楼2011-01-10 14:17:46
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:17:46:



我用的感受态细胞是DH5a,空载体转化,100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板,没有计数,大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板,长出阳性克隆是50个左右,阴性对照没有长出菌 ...

你还是 没有明白转化效率的重要性

空载体做转化没有不长的
13楼2011-01-10 14:22:52
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:22:52:


你还是 没有明白转化效率的重要性

空载体做转化没有不长的

哦,那我该怎样测量感受态细胞的转化效率呢?
14楼2011-01-10 14:24:25
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:24:25:


哦,那我该怎样测量感受态细胞的转化效率呢?

网上到处都是,百度一下就可以

一般就是转化0.1ng 看看100ul感受态能够长出多少个菌斑,换算成1ug的菌斑数就是转化效率
15楼2011-01-10 14:30:09
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:30:09:



网上到处都是,百度一下就可以

一般就是转化0.1ng 看看100ul感受态能够长出多少个菌斑,换算成1ug的菌斑数就是转化效率

哦,好,请问在转化过程中还需要注意哪些事项呢?
16楼2011-01-10 14:37:51
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:37:51:


哦,好,请问在转化过程中还需要注意哪些事项呢?

低温,轻柔,快速,无菌,一个高效感受态是前提,做连接产物(尤其你这还是退火的)至少也要6次方以上的效率,7次方最佳,8次方必成功

6次方以下就扔了吧
17楼2011-01-10 14:43:01
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:43:01:



低温,轻柔,快速,无菌,一个高效感受态是前提,做连接产物(尤其你这还是退火的)至少也要6次方以上的效率,7次方最佳,8次方必成功

6次方以下就扔了吧

恩,好,真是太感谢你了~请问你用的感受态细胞也都是自己制作的吗?
18楼2011-01-10 14:46:48
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silicare

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Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 14:46:48:

恩,好,真是太感谢你了~请问你用的感受态细胞也都是自己制作的吗?

分子克隆的就很好
19楼2011-01-10 14:49:04
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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Originally posted by silicare at 2011-01-10 14:49:04:



分子克隆的就很好

分子克隆?什么意思?是分子克隆书上面写的吗?
20楼2011-01-10 14:53:59
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