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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】DNA退火已有7人参与

大家谁做过单链DNA片段退火，形成双链的实验呢？还有DNA的磷酸化，都需要注意哪些问题？
我做了很多歌DN片段的退火和磷酸化，在确定载体没有问题的情况下，都不能与退火形成的DNA双链连接，哪个细节出错了呢。。。

我是先进行DNA退火，然后再将退火后的双链DNA进行磷酸化，具体步骤如下：
退火体系： 100pmol/uL的互补DNA单链各自加入10uL，再加入去离子水80uL，组成了100uL的体系，混匀，在PCR仪中退火，退火步骤如下：95摄氏度3min；每8s降低0.1摄氏度，降至25摄氏度，然后4摄氏度长期保存。

退火后的双链DNA进行磷酸化，用的是NEB公司的T4 多聚核苷酸激酶，是50uL体系：加入激酶Buffer 5 uL， DNA 15uL， T4多聚核苷酸激酶1 uL，ddH2O 29uL，于37℃ 温育30min，然后65℃ 20min 热失活。

以上是我的具体实验步骤，谢谢！

[ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:27 ]

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1楼 2011-01-09 22:15:38

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wangdandelia

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-01-10 13:15:01:

什么叫还不错，几次方？连接片段和空载体是两码事

我用的感受态细胞是DH5a，空载体转化，100uL涂抗性板长出的菌落是密密麻麻的整个平板，没有计数，大约是上千吧。
我自己的连接上的产物是100uL的转化产物涂板，长出阳性克隆是50个左右，阴性对照没有长出菌落。
请问连接和转化这些过程中还有没有特别的注意事项呢？昨天晚上听一位师姐说，感受态细胞从-80℃冰箱拿出来立刻用手捂化，然后立刻转化，而且感受态细胞最好用买的，那样转化效率会高一些。可是我们实验室的感受态细胞都是自己做的。