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qixinkumu

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】关于PCR产物和限制性内切酶产物跑出的电泳条带的问题

我在做一个snp基因分型的，用PCR—FRLP法，内切酶用的是MSPI，位点是VKORC1-1639G>A,若基因型是AA型，则片段为290bp;若为AG型，则切出来的片段为290、122、168bp；若为GG型，则切出来的片段为168、122bp。上图先。

从右边数第2、3是PCR产物，6、7、8、9是这个位点的酶切产物。跑出来的电泳图有几个问题，1是位点的PCR非特异扩增很严重，但是我的退火温度已经为63°C了，不知道还能改进哪些？2是最亮的条带明显超过了290bp，在300bp左右了都，但是PCR产物和酶切产物位置还差不多，是不是因为边缘效应呢？不明白为什么？
3是两边的maker跑的都不对称。哎，期待回答啊！！感激不尽！

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1楼 2010-12-09 00:20:44

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loop00

木虫 (小有名气)

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★ ★
qixinkumu(金币+1): 2010-12-09 01:13:49
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2010-12-09 08:27:01
qixinkumu(金币+4): 2011-04-25 20:18:23

电泳要跑的平的话电压一定要在5V/cm以下，电泳二十五分钟以上，两根电极铂丝之间的距离一般是15cm。所以是75V，半小时
至于PCR的非特异建议使用常规优化常用的冷启动和降落PCR，镁离子浓度也可以减低一点点试试，多态性分析..你这个引物应该是文献上的吧..如果是就参考一下别人，如果是自己设计的可以重新找一段设计，解决这个问题
嘿嘿