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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于western 求助，高手请帮帮忙
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neversaydi

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于western 求助，高手请帮帮忙 已有8人参与

我想跑185kd的蛋白。
想问一下，这样的话，
1.浓缩胶和分离胶应该各用多少浓度的啊？
2.转膜和电泳的时候应该怎么个条件啊。
因为第一次做，所有求教一下，请各位大师大侠不吝赐教，小女子在这里叩谢啦
谢谢
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neverdaydie!
1楼 2010-12-07 12:45:11
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shagrace

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by neversaydi at 2010-12-21 08:50:35:


那你们配的胶呢？
我们actin的条件差不多是 10% 5% 的胶
80V到红带出来，转成120V，一直到样品跑到底。
  如果分子量180kd的话，  你的这个条件，电泳能出来，那胶的浓度是多少？
跟楼上一样？ 转膜呢？ ...

最大的跑过120的，这么大的没跑过，Actin我用的是12%的。
你可以试试5%，先跑个MARKER看看
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15楼2010-12-24 14:08:03
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bingdong05

银虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-09 11:54:28
185kd，8%的胶应该可以，上层胶一般都是3%的，另外条件要根据你的膜以及转膜仪器来定
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2楼2010-12-07 16:31:46
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neversaydi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bingdong05 at 2010-12-07 16:31:46:
185kd，8%的胶应该可以，上层胶一般都是3%的，另外条件要根据你的膜以及转膜仪器来定

一般跑60KD左右，是电泳80V  2h左右，转膜300MA  90min。
那这样的话，180KD应该是怎么个条件呢？谢谢大师指点
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neverdaydie!
3楼2010-12-07 18:47:01
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:54:37
如果你有预染的蛋白marker的话，可以通过蛋白marker来确定，
如果没有的话100V 2 hours 应该可以，转膜时间最好长一点semi-dry可以2-3hours
赞一下(2人) 回复此楼
有勇气去改变你可以改变的,有度量去容忍你不能改变的,有智慧去区分上面的两种情况http://bbs.bioon.net/bbs/?66210
4楼2010-12-08 04:47:11
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