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adslye

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与解答~ 2010-12-07 14:21:53
引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2010-12-03 20:20:52:

我的模板长度为200BP 引物为细菌Ｖ３区引物　３４１Ｆ和５３４Ｒ　程序如下：　９４预变性　4　min ;94 变性1 min 55 退火 1 min  72延伸 1 min ，30 个循环 最后72 延伸 6分钟

退火和延伸都换成30s， 换高保真酶试试。模板稀释使用。
模板好短，问题应该出在这了。

试试吧，做了后把结果发上来，大家一起分享。
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21楼2010-12-03 23:26:13
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惟我独尊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-12-03 23:26:13:


退火和延伸都换成30s， 换高保真酶试试。模板稀释使用。
模板好短，问题应该出在这了。

试试吧，做了后把结果发上来，大家一起分享。

好滴 回头重做传上来 谢谢大家
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22楼2010-12-04 10:13:32
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YaYa785

银虫 (小有名气)
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与解答~ 2010-12-07 14:21:28
引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2010-12-03 20:20:52:

我的模板长度为200BP 引物为细菌Ｖ３区引物　３４１Ｆ和５３４Ｒ　程序如下：　９４预变性　4　min ;94 变性1 min 55 退火 1 min  72延伸 1 min ，30 个循环 最后72 延伸 6分钟

你的模板是200bp？
那你的目的片段是多大啊？
退火时间和延伸时间是根据你的目的片段大小定的，预测你这两步程序的时间太长....
还有你说的模板量4微升是pcr的模板量？太多了，50的体系1微升就很多了，若你的模板很浓，更应该稀释之后再加....pcr模板浓度时有规定的，细菌酵母质粒都不一样的...分子克隆上有，你查查...
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23楼2010-12-07 12:55:11
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惟我独尊

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by YaYa785 at 2010-12-07 12:55:11:



你的模板是200bp？
那你的目的片段是多大啊？
退火时间和延伸时间是根据你的目的片段大小定的，预测你这两步程序的时间太长....
还有你说的模板量4微升是pcr的模板量？太多了，50的体系1微升就很多了，若 ...

谢谢  我的模板是200bp 目的片段也是200bp啊  因为我的模板是从DGGE胶中提取出的 浓度应该很小 所以旧多加了点  我按照你的建议改进PCR程序再试一次吧 灰常感谢
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24楼2010-12-07 15:16:46
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YaYa785

银虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2010-12-07 15:16:46:

谢谢  我的模板是200bp 目的片段也是200bp啊  因为我的模板是从DGGE胶中提取出的 浓度应该很小 所以旧多加了点  我按照你的建议改进PCR程序再试一次吧 灰常感谢

胶回收用纯水吧   有时候洗脱液中的盐离子也会影响pcr的...
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25楼2010-12-08 11:05:53
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huweicheng

木虫 (小有名气)

DAD
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1。PCR产物降解 2。 引物设计有问题。
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ADFAS
26楼2010-12-08 11:13:31
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yaushz

木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-08 12:37:05
smear，很有可能是降解，比如我提取凋亡或坏死细胞DNA跑出来就这个样子——！
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27楼2010-12-08 11:32:12
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李战士

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
545596楼: Originally posted by 惟我独尊 at 2010-12-04 10:13:32
好滴 回头重做传上来 谢谢大家...

最后咋样了啊，怎么解决的呢？
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其实有很多事我们都知道，只是不愿意说出来
28楼2012-06-05 23:55:42
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