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[交流]
【求助/交流】真核细胞总蛋白抽提
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各位高人： 目前正在做真核细胞的表达。用GFP质粒表达的预实验表明整个转染及表达系统是没有问题的，但是自己研究的质粒转染后，却在上清中检测不到表达蛋白。初步推测有可能是信号肽不灵光，导致没有外分泌到上清中。 于是想裂解一下293T细胞看是否在胞内有表达，但是很难找到细胞裂解及抽提蛋白的溶液及步骤的资料，望各位高人指点，贡献自己的方法及详细步骤，配方。。。。谢过了先。。。 自己找的配方： Tris-HCl(pH8.0) 50 mmol/L NaCl 150mmol/L NaN3 0.02% PMSF 100ug/mL Aprotinin 1ug/mL TritonX-100 1% 使用前冰上预冷，加入裂解缓冲液后，冰浴20min。 刮取细胞裂解物，加入离心管中，4℃离心2min 取上清，测定值。。。。 [ Last edited by zplipeng on 2010-12-2 at 09:01 ] |
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2楼2010-11-30 12:55:25
zplipeng(金币+7):nice，，，谢谢啦。。。 2010-12-05 16:21:30
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上海生工有！ 全蛋白提取试剂盒 Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit 产品说明：本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效,可以提取出培养细胞或动物组织中的决大多数蛋白质。获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down,EMSA等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂，可以每次从107个培养细胞或200mg动物组织提取蛋白质，本试剂盒可以使用50次。储存条件：2～8℃。 产品特点： 1．提取的蛋白质包括膜,核,核基质和胞质蛋白,而且最大限度保持蛋白质活性； 2．整个操作过程只需要30分钟左右； 3．即可以用于培养细胞（50x107个），有可以用于动物组织（50x200mg）蛋白质的提取； 4．避免蛋白酶和磷酸酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性； 5．不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。 编号 包装 价格 产地 BSP003 50 Assays 520 生工 RIPA裂解液I RIPA Lysis Buffer I 产品说明：RIPA裂解液I对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有较强的裂解作用，可能是经典但最常用的细胞组织裂解液。使用RIPA Buffer制备用于Western特别是用于免疫共沉淀的裂解产物已经是一种首选的标准操作，适用于大部分抗原表位的检测，特别适用免疫共沉淀检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等。本产品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成.,为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g组织。含((Tris-HCL,Nacl , deoxycholate,SDS ,NP-40), proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail 。储存条件：2-～8℃。 编号 包装 价格 产地 PL005 10ml 225 生工 RIPA裂解液II RIPA Lysis Buffer II 产品说明：RIPA裂解液II对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有中等强度裂解作用，可能是经典但最常用的细胞组织快速裂解液。使用RIPA Buffer制备用于Western特别是用于免疫共沉淀的裂解产物已经是一种首选的标准操作，适用于大部分抗原表位的检测，特别适用免疫共沉淀检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等。本产品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成. 为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g组织。含有(NaCl,NP-40, deoxycholate, SDS,Tris), proteinase inhibitor and phosphatas inhibitor cocktail 。储存条件：2～8℃。 编号 包装 价格 产地 PL006 10ml 225 生工 RIPA裂解液III RIPA Lysis Buffer III 产品说明：RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)III对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有中等强度裂解作用，可能是经典但最常用的细胞组织快速裂解液。使用RIPA Buffer制备用于Western特别是用于免疫共沉淀的裂解产物已经是一种首选的标准操作，适用于大部分抗原表位的检测，特别适用免疫共沉淀检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用以及胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等,特别适用于核基质和核转录因子的提取，也可以用于收集的线粒体中的活性蛋白质的提取。本产品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成，含有EDTA，EGTA等成分，可以防止金属蛋白酶的降解作用，但是不太合适于NI-NTA目的蛋白的纯化和某些金属酶活性研究，为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g组织。含有(Tris-HCL , Nacl ,deoxycholate ,SDS，NP-40 , EDTA ，EGTA ), proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail.储存条件：2-～8℃。 编号 包装 价格 产地 PL007 10ml 225 生工 RIPA裂解液IV RIPA Lysis Buffer IV 产品说明：RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)IV对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有较温和的裂解作用，可能是经典但最常用的细胞组织裂解液。使用RIPA Buffer制备用于Western特别是用于免疫共沉淀的裂解产物已经是一种首选的标准操作，适用于大部分抗原表位的检测，特别适用免疫共沉淀检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等。本产品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成. 为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g组织。含有( Nacl ,Triton-x-100, deoxycholate, Tris ),proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail储存条件：2-～8℃。 编号 包装 价格 产地 PL008 10ml 225 生工 Western及IP细胞裂解液 Western and IP Cell lysis Buffer 产品说明：是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于SDS-PAGE，Western blot，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)，Western及IP细胞裂解液的主要成分为 Tris， NaCl，NP-40等，以及多种蛋白酶和磷酸酶抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g组织。储存条件：2-～8℃。 编号 包装 价格 产地 PL035 10ml 225 生工 |
3楼2010-12-05 15:27:41