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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNA纯化问题
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与，不过楼主说的是才产物纯化 2010-11-26 17:18:03
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-26 09:05:25:
请问各位虫友，在进行酶切之后纯化回收DNA，只是简单的纯化，不需要切胶，你们都是怎么纯化的？用哪个试剂盒比较好呢？我现在遇到了纯化的问题，真是举步维艰啊！

做连接转化过程中的酶切无非两种：PCR产物和质粒载体。

PCR产物一般带有酶切位点和保护碱基，而质粒载体多克隆位点的长度并不长，双酶切是为了保证连接时候的方向性。

我们实验室一般用的是QIAGEN的胶回收试剂盒，直接在产物中加入5倍的溶胶液，然后过柱回收，大约小于100bp的片段不会结合到柱子上，这样既保证了回收产物的纯度，也比切胶回收的效率高。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
11楼2010-11-26 12:30:45
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
哦，谢谢啊，请问我就是进行单酶切，把环状的切成线性的，也需要跑胶吗？
引用回帖:
Originally posted by littlehong at 2010-11-26 09:13:00:
酶切之后，一般要进行跑胶，把小片段跑掉，再切胶回收的。
如果楼主不跑胶，可以进行乙醇沉淀回收。
如果想用试剂盒的话，一般的溶胶回收试剂盒都可以用，不过要加入3倍体积的溶胶液，再正常回收。这样效率会挺好

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12楼2010-11-30 15:33:01
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
谢谢啊！
请问我是用单酶切，也要跑胶吗？把质粒从环状切成线状，用试剂盒纯化应该就可以了吧？
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-11-26 09:22:11:
还是跑胶在做胶回收吧
跑胶的时候也能跑掉一些不必要的杂带和一些杂质
最后一胶回收，DNA的纯度就挺高的啦
不然代上一些小片段的DNA进行到下一步的实验，也是挺麻烦的。

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13楼2010-11-30 15:35:09
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
你好，请问我是把质粒从环状切成线状，还会出现一些小片段吗？
引用回帖:
Originally posted by fjt198719 at 2010-11-26 09:29:38:
PCR产物酶切回收的话，一般直接用产物纯化试剂盒直接回收就的了，因为你的片段只有一条带，酶切只是切开两端的酶切位点和保护碱基；质粒酶切就不一样了，鉴于其不同存在类型，另外酶切有小片段，有时可能只切开一 ...

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14楼2010-11-30 15:36:55
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
载体酶切啊！ 我是把质粒单酶切 从环状切成线状，也要切胶回收吗？
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-11-26 09:39:13:
你是基因组酶切还是载体酶切？

基因组酶切后，用酚氯仿抽提1次，再氯仿一次，最后乙醇沉淀就好。

载体酶切，那就应该胶回收了。

不过也看你目的，一切都是要看你的实验目的而定。
核酸纯化，无非是有机 ...

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15楼2010-11-30 15:37:52
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
谢谢啊，是单酶切~
引用回帖:
Originally posted by violet.zhou at 2010-11-26 10:42:52:
酶切后如果是一条带就可以乙醇纯化啊
如果不是的话，只有切胶回收啊

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16楼2010-11-30 15:38:16
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:37:52:
载体酶切啊！ 我是把质粒单酶切 从环状切成线状，也要切胶回收吗？


如果之后还要做连接转化，建议切胶
有时候电泳看不见，但是还是会剩下没切开的质粒，这样最后转化的结果假阳性很高，再加上有的质粒不能用于蓝白斑筛选，挑克隆很麻烦
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17楼2010-11-30 16:27:20
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
恩，好的，如果实验结果不理想，就试一试你说的方法，谢谢！
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18楼2010-11-30 18:36:46
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adslye

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:37:52:
载体酶切啊！ 我是把质粒单酶切 从环状切成线状，也要切胶回收吗？


我认为没必要胶回收，你的产物只有一条带，乙醇沉淀去除一些杂质就好。没问题的。
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19楼2010-11-30 21:18:38
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:35:09:
谢谢啊！
请问我是用单酶切，也要跑胶吗？把质粒从环状切成线状，用试剂盒纯化应该就可以了吧？





那也是可以的
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
20楼2010-12-01 11:42:40
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