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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与,不过楼主说的是才产物纯化 2010-11-26 17:18:03
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-26 09:05:25:
请问各位虫友,在进行酶切之后纯化回收DNA,只是简单的纯化,不需要切胶,你们都是怎么纯化的?用哪个试剂盒比较好呢?我现在遇到了纯化的问题,真是举步维艰啊!

做连接转化过程中的酶切无非两种:PCR产物和质粒载体。

PCR产物一般带有酶切位点和保护碱基,而质粒载体多克隆位点的长度并不长,双酶切是为了保证连接时候的方向性。

我们实验室一般用的是QIAGEN的胶回收试剂盒,直接在产物中加入5倍的溶胶液,然后过柱回收,大约小于100bp的片段不会结合到柱子上,这样既保证了回收产物的纯度,也比切胶回收的效率高。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
11楼2010-11-26 12:30:45
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

哦,谢谢啊,请问我就是进行单酶切,把环状的切成线性的,也需要跑胶吗?
引用回帖:
Originally posted by littlehong at 2010-11-26 09:13:00:
酶切之后,一般要进行跑胶,把小片段跑掉,再切胶回收的。
如果楼主不跑胶,可以进行乙醇沉淀回收。
如果想用试剂盒的话,一般的溶胶回收试剂盒都可以用,不过要加入3倍体积的溶胶液,再正常回收。这样效率会挺好

12楼2010-11-30 15:33:01
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

谢谢啊!
请问我是用单酶切,也要跑胶吗?把质粒从环状切成线状,用试剂盒纯化应该就可以了吧?
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-11-26 09:22:11:
还是跑胶在做胶回收吧
跑胶的时候也能跑掉一些不必要的杂带和一些杂质
最后一胶回收,DNA的纯度就挺高的啦
不然代上一些小片段的DNA进行到下一步的实验,也是挺麻烦的。

13楼2010-11-30 15:35:09
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

你好,请问我是把质粒从环状切成线状,还会出现一些小片段吗?
引用回帖:
Originally posted by fjt198719 at 2010-11-26 09:29:38:
PCR产物酶切回收的话,一般直接用产物纯化试剂盒直接回收就的了,因为你的片段只有一条带,酶切只是切开两端的酶切位点和保护碱基;质粒酶切就不一样了,鉴于其不同存在类型,另外酶切有小片段,有时可能只切开一 ...

14楼2010-11-30 15:36:55
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

载体酶切啊! 我是把质粒单酶切 从环状切成线状,也要切胶回收吗?
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-11-26 09:39:13:
你是基因组酶切还是载体酶切?

基因组酶切后,用酚氯仿抽提1次,再氯仿一次,最后乙醇沉淀就好。

载体酶切,那就应该胶回收了。

不过也看你目的,一切都是要看你的实验目的而定。
核酸纯化,无非是有机 ...

15楼2010-11-30 15:37:52
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

谢谢啊,是单酶切~
引用回帖:
Originally posted by violet.zhou at 2010-11-26 10:42:52:
酶切后如果是一条带就可以乙醇纯化啊
如果不是的话,只有切胶回收啊

16楼2010-11-30 15:38:16
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ben1147

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:37:52:
载体酶切啊! 我是把质粒单酶切 从环状切成线状,也要切胶回收吗?


如果之后还要做连接转化,建议切胶
有时候电泳看不见,但是还是会剩下没切开的质粒,这样最后转化的结果假阳性很高,再加上有的质粒不能用于蓝白斑筛选,挑克隆很麻烦
17楼2010-11-30 16:27:20
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

恩,好的,如果实验结果不理想,就试一试你说的方法,谢谢!
18楼2010-11-30 18:36:46
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adslye

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:37:52:
载体酶切啊! 我是把质粒单酶切 从环状切成线状,也要切胶回收吗?


我认为没必要胶回收,你的产物只有一条带,乙醇沉淀去除一些杂质就好。没问题的。
19楼2010-11-30 21:18:38
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪

引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2010-11-30 15:35:09:
谢谢啊!
请问我是用单酶切,也要跑胶吗?把质粒从环状切成线状,用试剂盒纯化应该就可以了吧?





那也是可以的
青春的岁月,我们身不由己,只因这胸中燃烧的梦想!
20楼2010-12-01 11:42:40
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