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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】trizol 提ＲＮＡ中的一些问题
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oditors

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zuodongyun at 2010-11-25 19:46:53:
异丙醇是0.8体积，最好是预冷的
最后倒掉70%乙醇后，短暂离心，用枪吸去余液，干燥5分钟左右就可以了
最后只用20微升水溶就可以了
浓度低可能与你所提取的材料有关系

好多资料都是说500ul/ml tiizol的异丙醇！！！！这异丙醇的量是怎么定的啊？
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11楼2010-11-25 23:07:55
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-26 08:20:24
楼主的主要问题在于干燥时间过长了，10min已经是极限

其他什么异丙醇预不预冷都是浮云

另外我想说，既然楼主已经把RNA提出来了，只是浓度不行，那应该跟RNAse没什么太大关系。楼主防降解方面做得应该不错。
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12楼2010-11-25 23:21:42
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kwkw

木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-26 08:20:46
你在网上搜一个invitrogen公司的tiizol使用说明，完全按它上面的来，就没问题，异丙醇和乙醇都是常温的，根本不会预冷，我刚开始也提不好，课题组有个老外按说明书来，我发现不错，他的除了离心，其它都在室温下操作，并且不用无菌操作台，就用通风橱，因为tiizol剧毒。
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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
13楼2010-11-26 08:16:51
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛
★
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异丙醇需要预冷,等体积，冷的才容易沉淀，干燥在无菌操作台吹风15min，
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但愿人长久
14楼2010-11-26 08:40:59
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+5):辛苦~希望对楼主有所帮助 2010-11-26 09:35:53
TRIZOL法提取总RNA
（改进的一步法）

Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。

1.  在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2. 称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。（材料体积≤Trizol体积的10%）旋涡震荡混匀，15-30℃ 静置5分钟。
3. 去除胞壁残渣、多糖、蛋白、脂肪：
离心（4℃，1‚2000 ×g）10分钟。取上清至一新的EP管中。
4. 分相：
① 加0.2 ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟。15-30℃ 静置2-3分钟。
② 离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）15分钟。
5. 沉淀，并去除多糖：
① 用200μl的枪取无色水相（大约原初Trizol体积的60%，约600μl ）至一新的EP管中。切勿吸到中间层。
② 加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃ 静置10分钟。
③ 离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）10分钟。倾去上清。
6. 清洗：
① 用200μl的枪吸除多余上清，加1ml  冰预冷的75% 乙醇，旋涡震荡。
② 离心（4℃，7500 ×g）5分钟。
7. 用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。切勿干燥彻底，否则极难溶解。
8. 加适量的DEPC•H2O（一般20μl），枪打数次，使沉淀溶解。然后置于55-60℃ 水浴中彻底溶解10分钟。迅速冰浴，5分钟，稍离心。
9. 置于-70℃ 保存。
注意事项：
① 在第2步静置后，或第3步取上清后，可以在-70℃ 保存一个月。
② 在第6步旋涡震荡后，可在-4℃ 保存一周，或在–20℃ 保存一年。
③ 高盐溶液：0.8M柠檬酸钠+1.2M氯化钠，DEPC处理后高温灭菌。
④  通常用0.1-0.15 g材料可以提取 60-100 μg 总RNA。
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15楼2010-11-26 08:44:38
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oditors

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-26 08:44:38:
TRIZOL法提取总RNA
（改进的一步法）

Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。

1.  在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2. 称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。（材料体 ...

拜读！！！！谢谢，辛苦了
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16楼2010-11-27 00:53:59
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oditors

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sai00fuji at 2010-11-25 23:21:42:
楼主的主要问题在于干燥时间过长了，10min已经是极限

其他什么异丙醇预不预冷都是浮云

另外我想说，既然楼主已经把RNA提出来了，只是浓度不行，那应该跟RNAse没什么太大关系。楼主防降解方面做得应该不错。

其实都差不多，我有同学能吧RNA的OD260值做到1点多，他的干燥都30分钟。
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17楼2010-11-27 00:57:01
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ymjxl123

木虫 (著名写手)

风清扬
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引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-26 08:44:38:
TRIZOL法提取总RNA
（改进的一步法）

Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。

1.  在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2. 称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。（材料体 ...

你好，我想向你请教一下：
          氯仿的加入是在将trizol-样品粗液高速离心后加入还是在trizol-样品粗液充分混匀并静置一段时间后直接加入好呢？
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追求卓越，成功就会在不经意间追上你
18楼2011-03-05 23:53:47
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
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将trizol-样品粗液高速离心后取上清转移至新的管中，向该管加入氯仿。
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19楼2011-03-06 08:49:28
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lys0704

银虫 (著名写手)
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异丙醇最好预冷下，另外注意实验耗材都要做到高压或DEPC水处理
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服务大众
20楼2011-03-07 13:44:09
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