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oditors

银虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】trizol 提ＲＮＡ中的一些问题已有17人参与

小弟要用Trizol提RNA，但是一直都提不好。查一些资料，总结出下面一下问题，希望大虾们给我解说一下！！！
1、提RNA过程中，那个异丙醇的量以什么为标准？我现在是定500ul。异丙醇需要预冷吗？常温下用影响大吗？我一直都是常温提的。
2、洗涤沉淀后，在空气干燥时，一般干燥多久啊？我有试过30分钟，也试过几分钟，但是最后复溶的效果都不好，浓度都偏低，而且30分钟时，原来明显的白色沉淀会溶解不见。
3、我提RNA的浓度一直都不好，有什么办法能够把浓度提上去啊！

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1楼 2010-11-23 16:41:33

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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+5):辛苦~希望对楼主有所帮助 2010-11-26 09:35:53

TRIZOL法提取总RNA
（改进的一步法）

Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。

1.  在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2. 称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。（材料体积≤Trizol体积的10%）旋涡震荡混匀，15-30℃ 静置5分钟。
3. 去除胞壁残渣、多糖、蛋白、脂肪：
离心（4℃，1‚2000 ×g）10分钟。取上清至一新的EP管中。
4. 分相：
① 加0.2 ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟。15-30℃ 静置2-3分钟。
② 离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）15分钟。
5. 沉淀，并去除多糖：
① 用200μl的枪取无色水相（大约原初Trizol体积的60%，约600μl ）至一新的EP管中。切勿吸到中间层。
② 加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃ 静置10分钟。
③ 离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）10分钟。倾去上清。
6. 清洗：
① 用200μl的枪吸除多余上清，加1ml  冰预冷的75% 乙醇，旋涡震荡。
② 离心（4℃，7500 ×g）5分钟。
7. 用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。切勿干燥彻底，否则极难溶解。
8. 加适量的DEPC•H2O（一般20μl），枪打数次，使沉淀溶解。然后置于55-60℃ 水浴中彻底溶解10分钟。迅速冰浴，5分钟，稍离心。
9. 置于-70℃ 保存。
注意事项：
① 在第2步静置后，或第3步取上清后，可以在-70℃ 保存一个月。
② 在第6步旋涡震荡后，可在-4℃ 保存一周，或在–20℃ 保存一年。
③ 高盐溶液：0.8M柠檬酸钠+1.2M氯化钠，DEPC处理后高温灭菌。
④  通常用0.1-0.15 g材料可以提取 60-100 μg 总RNA。