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xinyaolu

木虫 (小有名气)

MolEPI: 1
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虫号: 867815

[交流] 【求助/交流】大肠表达遇到的让人纠结的蛋白，求解

本人最近在做一个植物蛋白100kd，两对二硫

键。大肠表达，pet32a。初期很轻松的就在胞内得到可溶表达，但是无论如何优化温度和IPTG浓度，都无法得到活性的蛋白，测不到酶活。此后，在破壁上清液中添加了0.4M L-Arg,20摄氏度10h后，能够检测到酶活。但是在发酵过程中直接添加0.1-0.4M 精氨酸没有效果

不知有没有虫友遇到过相似的问题，帮忙解决一下：

1.在精氨酸添加前后，蛋白可能发生了那些变化，这些变化如何通过实验验证？

2.如何在发酵过程中直接得到活性的蛋白？

3.哪位虫友有相关的文章可能会对这个实验有所帮助，请在回帖中给个题目

非常感谢

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1楼 2010-11-14 20:36:16

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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

应助: 37 (小学生)
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虫号: 201353

★
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首先，植物基因建议在酵母表达。
体外反应中精氨酸的作用可能是帮助蛋白refold，你直接表达的蛋白虽然可能，但是折叠可能仍有问题。你在发酵时直接加入精氨酸的话，精氨酸会被代谢掉，没有对应的效果。
如果坚持在大肠表达的话，可以考虑目标基因和分子伴侣共表达，可以考虑takara的chaperone质粒。