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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xinyaolu

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】大肠表达遇到的让人纠结的蛋白,求解

本人最近在做一个植物蛋白100kd,两对二硫键。大肠表达,pet32a。初期很轻松的就在胞内得到可溶表达,但是无论如何优化温度和IPTG浓度,都无法得到活性的蛋白,测不到酶活。此后,在破壁上清液中添加了0.4M L-Arg,20摄氏度10h后,能够检测到酶活。但是在发酵过程中直接添加0.1-0.4M 精氨酸没有效果

不知有没有虫友遇到过相似的问题,帮忙解决一下:

1.在精氨酸添加前后,蛋白可能发生了那些变化,这些变化如何通过实验验证?

2.如何在发酵过程中直接得到活性的蛋白?

3.哪位虫友有相关的文章可能会对这个实验有所帮助,请在回帖中给个题目

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高亚楠六

铜虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
您好,请问这个问题怎么解决的,为什么要加精氨酸
2楼2016-05-05 15:38:23
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
首先,植物基因建议在酵母表达。
体外反应中精氨酸的作用可能是帮助蛋白refold,你直接表达的蛋白虽然可能,但是折叠可能仍有问题。 你在发酵时直接加入精氨酸的话,精氨酸会被代谢掉,没有对应的效果。
如果坚持在大肠表达的话,可以考虑目标基因和分子伴侣共表达,可以考虑takara的chaperone质粒。
3楼2016-05-06 09:19:23
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