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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR问题求解，2段基因连接
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
你用的什么条件哦?
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11楼2010-11-05 19:49:39
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sayfxxk2u at 2010-11-05 10:33:53:

SOE-PCR，是不是可以互为引物模板？那不是不用加我自己设计的引物了？

对长片段，你自己设计引物还是必要的。如果你的两段序列都不长，比如几十bp，你就可以全合成。合成的时候设计一段互补配对的区段。就不用引物了。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
12楼2010-11-05 20:04:06
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云泽紫樱

银虫 (小有名气)
sayfxxk2u(金币+1):谢谢告诉 2010-11-19 16:00:42
引用回帖:
Originally posted by sayfxxk2u at 2010-11-05 10:35:48:

当时查的说12个bp就够了，所以设计了12bp的引物，如果这样，还得再设计引物，然后重新PCR 2个基因，再联合？
你的那个退火的温度和PCR策略是？

退火温度是58℃，30s。
1.94℃，2min
2.94℃，30s
3.58℃，30s
4.72℃，4min。2-4循环30次。用的是pfu DNA polymerase

我觉得设计引物是主要是互补的那段序列的方向要特别注意，我设计的时候互补序列的方向仔细弄了弄。

希望能帮到你~
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“幸福”就是猫吃鱼，狗吃肉，奥特曼打小怪兽~
13楼2010-11-08 15:49:10
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sayfxxk2u

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2010-11-05 20:04:06:

对长片段，你自己设计引物还是必要的。如果你的两段序列都不长，比如几十bp，你就可以全合成。合成的时候设计一段互补配对的区段。就不用引物了。

引物设计出来，2个互补的序列是配对的。我现在已经把B段2500bp的，用一个中间引物弄成了B1和B2，B1是1030，B2是1480左右。然后用A和B1为模板，A上和B1下为引物，PCR出来，模板A：B1=0.4ul：0.6ul。然后有一条大于1000bp的带（A-260bp+B1-1030bp=1400bp）和一个小于1000的带。取1400的带，PCR后的纯化产物AB1，和B再一个条件混合，以A上和B下引物，PCR。。现在问题是这2个模板有1030bp的重合，能否P出？
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14楼2010-11-19 17:16:58
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