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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR问题求解，2段基因连接
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sayfxxk2u

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR问题求解，2段基因连接

做PCR，用1上1下引物P出来一个基因，250bp，然后用2上2下p出另外一个基因，2500bp。现在我如何把这2个基因连接起来为模板继续p？
我的做法是把1下和2上这两个引物设计成有12个bp的互补，让他们p出来的2个基因可以有12个碱基的互补，然后再用1上和2下对这个互补的基因进行PCR，但是具体该如何设计呢？P一次，发现是引物2聚体的。。变性和退火温度是如何依据的？
请高手指点。。。
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1楼 2010-11-04 22:14:35
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云泽紫樱

银虫 (小有名气)
sayfxxk2u(金币+1):谢谢告诉 2010-11-19 16:00:42
引用回帖:
Originally posted by sayfxxk2u at 2010-11-05 10:35:48:

当时查的说12个bp就够了，所以设计了12bp的引物，如果这样，还得再设计引物，然后重新PCR 2个基因，再联合？
你的那个退火的温度和PCR策略是？

退火温度是58℃，30s。
1.94℃，2min
2.94℃，30s
3.58℃，30s
4.72℃，4min。2-4循环30次。用的是pfu DNA polymerase

我觉得设计引物是主要是互补的那段序列的方向要特别注意，我设计的时候互补序列的方向仔细弄了弄。

希望能帮到你~
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“幸福”就是猫吃鱼，狗吃肉，奥特曼打小怪兽~
13楼2010-11-08 15:49:10
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段家一凡

木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-05 08:41:11
12个bp太短了吧，你设计再长一点就好了。退火温度应该是已12bp为准。
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2楼2010-11-05 00:28:36
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-05 08:41:22
参考SOE-PCR。
重叠部分可以长一点。
赞一下(1人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
3楼2010-11-05 01:10:22
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云泽紫樱

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-05 10:34:49
reasonspare(金币+2):谢谢分享。详细点更好。 2010-11-05 12:01:24
我设计的是互补18bp，融合了885bp的产物和1131bp的产物
赞一下(2人) 回复此楼
“幸福”就是猫吃鱼，狗吃肉，奥特曼打小怪兽~
4楼2010-11-05 10:14:07
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