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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接体系优化办法已有8人参与

我用pTXB1连接一个1194bp的片段,连了很多次,但是一直连不上,体系是
pTXB1  8 ul  目的片断 4 ul  水  5 ul  10*buffer 2 ul  T4 DNA 连接酶 1
请教大家了,急.............
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天龙n部

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-16 14:48:40
你算下你的载体和目的基因的摩尔比,最好达到1:3这样一般就可以额。还有就是可能你的buffer用久了,里面的ATP挥发了,补救措施要么换个新的buffer,要么在原buffer里加点ATP。最后,可能是你的酶失效了,如果你们用煤一直在冰盒里的话一般不会出现这种情况。体系做正交那没必要,不是浪费酶嘛
14楼2010-10-16 14:12:10
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)

silicare:体积比不是摩尔比 2010-10-15 11:52:40
薄荷zwz(金币+1): 2010-10-15 13:16:19
你的连接比例载体:基因是2:1,这个比例不知道你是怎么确定的。一般连接不成功或效果不好和连接比例没控制好有很大关系,所以你要根据酶切回收后的载体基因的浓度确定最佳连接比例。
2楼2010-10-15 10:42:18
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kissing

新虫 (初入文坛)

连接

把酶切后的目的基因和载体跑胶,用Gis软件分析,精确二者的用量
3楼2010-10-15 10:43:24
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星

做链接载体与目的片段要严格定量,否则连接效率非常低!
海阔凭鱼跃,天高任鸟飞!
4楼2010-10-15 12:56:09
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