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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】MBP融合蛋白的Amylose亲和层析
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baijing114

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】MBP融合蛋白的Amylose亲和层析

请问有没有人做过关于MBP融合蛋白的Amylose亲和层析的实验啊？我现在做老是纯化不出来，这个图是我做的成功的时候，就一条目的条带.这个图是我纯化不出来的电泳图，有很多杂带，这两次实验条件什么的都没变，现在再也做不成功了，请教一下大家是什么原因

[ Last edited by baijing114 on 2010-10-14 at 14:20 ]
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1楼 2010-10-14 14:19:34
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2010013814

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
柱材清洗使用0.1%SDS浸泡就可以了，ＳＤＳ和蛋白质结合，就可以清洗掉柱子里的残留蛋白。ＳＤＳ属于弱碱，也不会对柱材强的损害。
这种情况，杂蛋白结合很多，特异性不强的的亲和柱。
１、上清与柱材４℃，搅拌孵育１.５ｈ，有利于结合。洗脱，再用ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ平衡柱子。
２、穿出收集，同１步骤再次过柱。
３.收集两次或三次这样的ｅｌｕｔｉｏｎ。
４.透析除掉ｍａｌｔｏｓｅ
５.ｅｌｕｔｉｏｎ与柱材孵育，同１，穿出大部分杂蛋白，洗脱的目的带就很纯了
６.酶切
７.过Ｑ柱（分开标签和目的蛋白），大多数蛋白带负电。在这里是很难除掉的。

ｐｓ：如果过ＳＰ阳离子交换柱，杂蛋白穿出。可省去透析再亲和的步骤。直接酶切ＳＰ柱就行了。
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暗物质
12楼2015-05-22 11:13:33
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
baijing114(金币+5):我的柱子是新的，第一次做就是这个效果，第一次做的时候成功了，以后就再也没做出来 2010-10-15 10:18:36
是不是柱子不行了？有没有把纯化过程中的其他成分电泳比较下。
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52187644
2楼2010-10-14 15:41:46
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励下~ 2010-10-14 18:20:31
MBP标签纯化起来要比常用的His，GST难一些啊，如果可以的话建议还是用简单标签进行纯化。
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3楼2010-10-14 17:24:27
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):鼓励下` 2010-10-14 19:23:36
baijing114(金币+10):谢谢您的指点，我想进一步向您请教一下，看看我到底哪一步实验出了问题 2010-10-15 09:51:53
偶前一段时间试了一次MPB标签的纯化，相对于我以前使用的His标签它的结合能力确实有点低，但是纯化出来后确实很纯。
亲和层析很需要注意的一点是目的蛋白的量和层析填料使用的比例要适当。填料承载蛋白的量如果远远大于你的蛋白，这样咋蛋白相对就容易挂上去了。
MBP层析时记得看看说明书上的流速，我印象中好像它是要求高流速的，流速低了咋蛋白也容易挂上去。
填料使用时间长了最好进行较为彻底的清洗。
如果你的蛋白纯化出来浓缩过，那么给人的感觉就是蛋白的纯度会降低。

另外不要太期望着通过一次亲和层析就获得高纯度的蛋白，除非你使用蛋白酶进行酶切。
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4楼2010-10-14 19:07:59
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