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我是果果

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教连接转化方面的问题 已有4人参与

我的目标片段有1400bp,琼脂糖凝胶电泳时有两条带,相隔很近,据说可能是两个亚型,切胶切不开,只能做连接,但连了几次都没连上,用的是pMD19-T载体,每次都只长出三四个菌落,而且都不是我要的,求助于各位高手!谢谢啦~
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amilie030312

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by xinmucong123 at 2010-10-12 21:35:17:
加大回收片段的浓度,或者换个载体,我有个4000多的刚开始用PMD-19连不上,后来把回收片段浓度加大了,换了promaga的T载体,就连上了

说的应该是Thermus Aquaticus DNA Ligase,就是Taq DNA连接酶。不过据我所知,Taq DNA 连接酶连接双联DNA中的单链切刻比较有效。我还是认为T4效果比较好,而且平末端和粘性末端都能连。
14楼2010-10-15 13:57:52
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月月大可

木虫 (著名写手)

★ ★
scelab(金币+2):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:28:45
奇怪了,做TA克隆还能有不长的。

酶能不能加A? 回收的时候是否充分晾干乙醇?

TA克隆随便一连长的满板子都是,建议楼主从头开始反思自己的操作,注意细节问题。
2楼2010-09-15 15:46:38
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jasco

木虫 (正式写手)

用的是taq酶么?如果用的pfx扩的需要加A才能连上T载
3楼2010-09-15 15:49:35
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lu_zl

银虫 (小有名气)

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-09-15 23:28:51
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:20
我相信楼主不会粗心到用高保真酶去PCR的。问题很可能是你的扩增片段浓度太低了,加大对载体的比例再连接。

还有你的平板中抗生素,IPTG XGAL等等有没有失效的?
4楼2010-09-15 15:59:46
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