应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。
52/1返回列表
查看: 3190  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。 已有15人参与

这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍)


就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）



后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理：

（TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。）

                             原    液      稀释50倍  稀释100倍        原  液

模板量                     2.5  1       2.5     4     4      4          1    1

引物量 （10um）      4     4        8       8     8       8         8    8



以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。



结果见第3张图，效果还不如第2张好。



请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！

[ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2010-09-07 21:55:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杜杜

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第二次pcr的时候，模板量加体系总体积的1/10，循环数3-10个应该可以，试试吧
赞一下 回复此楼
18楼2013-01-04 09:52:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

周_yan

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
andywang6137(金币+2):谢谢指点 2010-09-09 16:58:52
跑的不怎么好，都拖尾了，并且目的条带也不是很亮，建议不要回收。
跑的不好，可能是电泳液和上样的问题，建议换一新电泳液再跑一次。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-09-08 09:21:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stliimoon

金虫 (小有名气)
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 16:59:34
你的这个引物量加的太多了吧！照你这个引物浓度，50ul的体系加入0.5μL就算是最多了吧。taq的量可能也不太好吧，我觉得要是一般的taq，50ul体系加taq0.5ul，要不你这样试试，10*taq buffer,5ul;10um的dNTP 4ul;10um引物,1ul，模板就按你自己的量，taq，0.5ul.其他是水。
同时做一下温度梯度看看。
赞一下 回复此楼
3楼2010-09-08 15:21:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
andywang6137(金币+3):谢谢指点 2010-09-09 16:59:52
我觉得你第二次PCR的时候PCR产物加太多了！因为第一次PCR时就有很多杂带，第二次PCR的模板多，也会相应增加杂带扩增的可能性，所以，你把第一次PCR产物稀释一下再做试试！
要不就是你的引物设计的不太好！个人意见！仅供参考！呵呵！
赞一下(1人) 回复此楼
麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
4楼2010-09-08 15:30:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +8 ziyangfang 2026-08-25 11/550 2026-09-01 09:51 by zzuzxg
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭