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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？
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自由飞扬

铁虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
月月大可(金币+1):偶搞结构的，貌似遇到同行了 2010-08-21 18:38:48
silicare(金币+1):谢谢交流 2010-08-31 08:28:46
我看过很多结构的文章，在OD这么高的时候诱导好像很少诶。。我们都是在0.8左右诱导的，OD过高了细菌的生长状态就不一样了。

另外换载体可能有效，但我觉得OD值是主要原因，毕竟原核蛋白应该很容易表达的

如果不是OD值的原因，你还可以换个培养基，试试自诱导培养基，ZYP-5052什么的
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我了个擦，这倒霉ID不是我自己起的不是我自己起的
11楼2010-08-21 10:57:23
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muchongchong838

禁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
月月大可(金币+1):这个需要的周期略长了，等不及了 2010-08-21 18:40:03
本帖内容被屏蔽
12楼2010-08-21 11:33:53
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
silicare(金币+1):谢谢交流 2010-08-31 08:29:05
对于OD问题我感觉不是核心问题所在。我所表达的各种蛋白都是在此诱导后。0.8诱导蛋白的产量太少（特别是一些需要低温过夜诱导的）。我需要非常多的蛋白供我纯化后结晶试验。

我正在积极尝试使用MBP融合蛋白，看看把目的蛋白藏在这么大的标签后会不会有明显的效果。
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13楼2010-08-21 18:30:37
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yingq1

木虫 (小有名气)
★
月月大可(金币+1):谢谢 2010-08-22 17:20:56
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-08-31 08:29:26
个人以为提高表达量载体构建很重要，启动子的强弱，要表达基因的大小，载体大小等，一个好的载体对表达很有帮助。我初学表笑话
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14楼2010-08-22 12:42:09
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
silicare:趁现在还是花老板的钱，赶紧折腾 2010-08-31 08:30:12
引用回帖:
Originally posted by bunny0512 at 2010-08-21 10:24:51:
1、更换载体是否有可能对蛋白的表达量产生极大的影响？
      应该是有影响的，比如我用GST带我的目的基因，蛋白量几乎没有
      换了带strep标签的质粒就有少量表达，不过不好纯化

2、加入融合蛋白（MBP G ...

你师姐真能折腾，呵呵
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15楼2010-08-22 15:21:17
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
★
月月大可(金币+2):谢谢 2010-08-29 16:42:57
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-08-31 08:30:28
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-19 23:19:23:
一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个蛋白表达量偏低，不知道大家有何建议？

构建在pET28a载体上，170AA。稀有密码子分析显示个数很少，没有连续串联出现；同源度77%（氨基酸）功能相同的另一蛋白表达 ...

一、你所说的西游密码子很少，是多少？其中有没有大肠杆菌中非常少见的密码子？要是有还是可以考虑优化一下密码子！
二、表达载体更换是可以考虑的，最好是更换成启动子和pET系列不一样的载体试试！
三、考虑融合表达也是一种策略，但是要考虑融合表达部分会不会影响你蛋白质的活性，要是影响，还得切除融合部分，切除的成本高不高？这个问题对于生产很重要！
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大家共同交流、共同提高！！！
16楼2010-08-23 08:51:49
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crazysong

木虫 (正式写手)
月月大可(金币+1): 2010-08-29 16:43:04
更换载体可以一试。
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17楼2010-08-23 09:11:21
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
★
月月大可(金币+1):应该没有毒性，同源蛋白表达的很欢 2010-08-29 16:43:38
silicare(金币+1):谢谢交流 2010-08-31 08:33:05
1。尝试换载体，我曾经也有类似问题，后来换了载体就好了；
2。感觉你诱导之前的OD应该0.6-1.0比较好；
3。蛋白是否有毒性。
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where there is a will,there ia a way.
18楼2010-08-23 15:19:44
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xiuxiu9803

新虫 (初入文坛)
月月大可(金币+1):感谢 2010-08-31 12:08:39
1挑选不同的菌株
2降低表达温度
3换载体
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19楼2010-08-30 22:28:48
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-08-31 08:33:20
月月大可(金币+1):感谢 2010-08-31 12:09:27
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-19 23:19:23:
一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个蛋白表达量偏低，不知道大家有何建议？

构建在pET28a载体上，170AA。稀有密码子分析显示个数很少，没有连续串联出现；同源度77%（氨基酸）功能相同的另一蛋白表达 ...

加入融合蛋白（MBP GST等）会不会明显提高蛋白表达量？
这个可以考虑，很多时候不是密码子问题，奇怪，加入MBP,GST这些大的溶解性比较好的tag确实可以提高蛋白表达量，并且有文章报道（基于高通量蛋白表达成功率分析），但是也是实验描述，原因不知道。
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20楼2010-08-31 00:36:42
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