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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药物化学 » 【求助】求助：HPLC定量,得出无法解释的结果？
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wangd556

[交流] 【求助】求助：HPLC定量,得出无法解释的结果？ 已有2人参与

第一次用HPLC定量,得出无法解释的结果,请各位大侠帮忙.

用A物质标准品(固体粉末),ddw制成0.5mg/ml溶液，分别进样5ul，10ul，15ul，20ul，25ul，30ul，50ul进行 HPLC，根据标准品HPLC检测时的峰高，制得峰高与进样量关系的标准曲线y=31.286x+609.64(R2=0.98)。

将待测样品X（固体粉末），ddw制成0.5mg/ml溶液，进样10ul（质量为5ug），HPLC检测，A物质的峰高为1280.1，根据标准曲线的计算得HPCL检测的10ul X样品中A物质的含量为32ug,可是X物质进行HPLC检测时，进样总质量不过5ug,A物质在其中的含量怎么可能为32ug（〉5ug）呢？

目前，我能够想到的原因：

1，样品配置的时候出现了问题：
但是，A和X物质同时进行称量、配制，都是取20mg样品，溶于200ul ddw，配成100mg/ml母液，然后取5ul母液ddw稀释至1ml,配成0.5mg/ml的检测溶液。如果配制过程有问题，那么两种物质的溶液浓度就会都有问题，不会两者之间有这么大的差异。

2，X样品在A吸收峰的地方，还有另外一种物质的吸收峰：
但是，HPLC的条件（流动相中有机相和无机相的配比）做过多次改动，X物质中A物质出峰时间与A物质标准品的出峰时间总是一致的，没有看见X物质的A峰周围有其它峰出现；并且，X物质的A峰，很犀利，不像夹杂有其它物质。

不知道还有什么问题，我忽略掉了，没有注意，请各位大侠指点。


本试验也用峰面积作过标曲，R2=0.95；而用峰高作标曲时，R2=0.98,线性更好一些。所以后来的试验用的是有关峰高的标准曲线。
另外，即使用峰面积的标曲计算，还是得到同样的结果。
请各位大侠指教。



根据峰高，而做的标准曲线



标准品的HPLC峰图



待测样品X的HPLC峰图
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1楼 2010-08-12 10:49:36
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jiayoua

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
westzilch(金币+1):谢谢交流！ 2010-08-12 11:50:49
基线不是很平啊，而且这条件出峰太快了，感觉你的样品峰前面有一些杂质，所以造成你计算的结果变大，另外检测波长最好能调一下
赞一下(2人) 回复此楼
知道不知道~~~
2楼2010-08-12 11:00:10
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wangd556

引用回帖:
Originally posted by jiayoua at 2010-08-12 11:00:10:
基线不是很平啊，而且这条件出峰太快了，感觉你的样品峰前面有一些杂质，所以造成你计算的结果变大，另外检测波长最好能调一下

以下是做标曲的原始数据
5        721.2
7.5        861.3
10        945.4
12.5        1011.8
15        1090.7
25        1373.9



HPLC整个过程采用梯度洗脱，条件是:
time(min)                     乙腈（%）      0.05%三氟乙酸（%）
0                                         10                                    90
8                                         18                                    82
8.1                                      100                                 0
12                                       100                                 0
15                                        10                                  90

210nm检测
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3楼2010-08-12 13:58:04
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wangd556

引用回帖:
Originally posted by jiayoua at 2010-08-12 11:00:10:
基线不是很平啊，而且这条件出峰太快了，感觉你的样品峰前面有一些杂质，所以造成你计算的结果变大，另外检测波长最好能调一下

是3min的那个很高的峰

请问如何让出峰时间延迟呢？


请问什么叫“样品好像在死体积附近”，我应该怎么改进方法呢？
“改善分离条件，如使用离子对是试剂 ...”请问什么是“离子对是试剂”呢？


标准曲线的横坐标是表示A物质的质量，我的计算过程是
（1280.1-609.64）/31.286=21ug
刚才，把一楼的结果写错了，已经改过来了，呵呵
不过还是21ug〉5ug，请大家再帮我想想这是为什么呢？

[ Last edited by wangd556 on 2010-8-12 at 14:37 ]
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4楼2010-08-12 14:35:40
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