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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】在真菌基因组中PCR基因，难吗？
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
基因组的质量很重要，你可以做个基因组浓度梯度：我一般体基因组后溶解30ul，模板用1ul或者2ul就差不多。
不过引物也是很重要的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
11楼2010-07-30 17:10:18
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-07-30 17:10:18:
基因组的质量很重要，你可以做个基因组浓度梯度：我一般体基因组后溶解30ul，模板用1ul或者2ul就差不多。
不过引物也是很重要的。。。

非常感谢！
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12楼2010-08-04 09:51:41
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-07-30 16:47:23:

最好把你之前提DNA跑的电泳图发上来看看

谢谢！
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13楼2010-08-04 09:52:01
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glucidum

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的黑曲霉菌株是测序菌株吗?
如果是测序菌株那你主要应该考虑如何进行PCR体系优化,如各组分的浓度及反应温度等;如果不是测序菌株的话，那需要考虑一下你的菌株与测序菌株之间可能存在的差异，你根据测序菌株基因序列设计的引物在你使用的菌株中没有匹配序列,要么多设计几对引物要么换测序菌株。
我曾经从一个黑曲霉突变株中克隆一个基因，先后试了3对引物才扩增出来，测序后发现我的菌株中基因与Genbank中的基因序列只有87%的相似度。
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14楼2010-08-04 10:02:00
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by glucidum at 2010-08-04 10:02:00:
你的黑曲霉菌株是测序菌株吗?
如果是测序菌株那你主要应该考虑如何进行PCR体系优化,如各组分的浓度及反应温度等;如果不是测序菌株的话，那需要考虑一下你的菌株与测序菌株之间可能存在的差异，你根据测序菌株基因 ...

谢谢，我需要同时做两株菌。其中一株是ATCC1015，另一个是诱变株。
诱变株没有测序过，是要设计简并引物吗？需要注意哪些问题啊？
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15楼2010-08-04 13:17:58
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glucidum

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-08-04 13:17:58:


谢谢，我需要同时做两株菌。其中一株是ATCC1015，另一个是诱变株。
诱变株没有测序过，是要设计简并引物吗？需要注意哪些问题啊？

如果ATCC1015能扩出来,而你的诱变株扩不出来的话，那你要多设计几对引物了，可以考虑多选几段序列合成引物,然后互相组合进行PCR.
如果ATCC1015也没扩出来的话，那你优化一下反应体系先吧.
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16楼2010-08-05 08:27:37
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547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
基因组大了,没有大肠杆菌好扩增.我也遇到困难,是通过多设计不同的引物,做各种组合成对扩增来找到能成功PCR目的片段的.
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为什么
17楼2012-07-09 12:24:09
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★
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如果为了检查基因组模板质量可以合成一对18S通用引物P一下看看，引物序列与条件网上都有，18S通用引物如果P不出来说明就是基因组质量有问题，重新氯仿抽提再乙醇沉淀~~~
另外，你说你的基因组浓度不高，可以直接加1~2μL到50的体系里面的，不用稀释~~~
如果18S PCR有结果目的基因木有结果，那就是其他的原因了，可以优化体系及反应条件，实在做不出来就换引物，重新设计合成引物，我从黑曲霉里面P一个1.8K的基因，优化了一个多月没有结果，换引物后一次就出来了~~~
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18楼2012-07-09 16:21:40
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wym901116

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
921173楼: Originally posted by hyhyyl at 2010-07-30 12:45:18
哈，你PCR的模板浓度优化了吗？太高时扩不出的
再就是你的模板质量怎么样，蛋白质不要紧不大影响，但是绝对不能有苯酚等有机试剂

模板浓度高。是不是有拖尾的感觉？我没有目的带，只有杂带
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加油
19楼2013-03-27 12:44:58
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