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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】在真菌基因组中PCR基因,难吗? 已有10人参与

我提取黑曲霉基因组,PCR三段片段,分别为6kb,6kb,1.6kb。结果都是杂带,没有目的带。
而我以大肠基因组为模板PCR一段基因,却非常顺利。
是黑曲霉PCR引物我设计的不好?还是真菌基因组为模板的PCR本身就不好做?
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果为了检查基因组模板质量可以合成一对18S通用引物P一下看看,引物序列与条件网上都有,18S通用引物如果P不出来说明就是基因组质量有问题,重新氯仿抽提再乙醇沉淀~~~
另外,你说你的基因组浓度不高,可以直接加1~2μL到50的体系里面的,不用稀释~~~
如果18S PCR有结果目的基因木有结果,那就是其他的原因了,可以优化体系及反应条件,实在做不出来就换引物,重新设计合成引物,我从黑曲霉里面P一个1.8K的基因,优化了一个多月没有结果,换引物后一次就出来了~~~
18楼2012-07-09 16:21:40
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qingxiong

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
是不是扩增的片段太长了呢?
2楼2010-07-30 12:00:24
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qingxiong

木虫 (正式写手)

★ ★
看天(金币+2):鼓励交流 2010-07-30 12:20:21
又或者是真菌模板质量不好呢,扩不出来有很多原因的,扩增体系,扩增条件优化了没有呢?
3楼2010-07-30 12:01:36
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by qingxiong at 2010-07-30 12:01:36:
又或者是真菌模板质量不好呢,扩不出来有很多原因的,扩增体系,扩增条件优化了没有呢?

基因组好像提得不好,量很少。做过退火温度梯度和模板浓度梯度,都没有目的带。杂带是在退火温度低、模板浓度大的时候比较亮。
觉得主要还是引物的问题?关键是目的带就没有,杂带还挺亮的。很郁闷。
4楼2010-07-30 12:37:25
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