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【求助/交流】枯草芽孢杆菌电转化
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| 请高人指教：枯草芽孢杆菌电转化感受态的做法以及枯草芽孢杆菌电转化步骤 谢谢啦 |
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shuangzi8761
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shuangzi8761
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yesucao
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西瓜(金币+1): 热心哈 2012-03-07 12:16:39
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百度出来的，我也在做枯草的电转化，大致的过程是这样子，具体的参数还得自己慢慢摸索啊 枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法）转化 1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。 2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95. 3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。 4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。 5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120。 6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。 电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率） 7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。 准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。 |
3楼2011-10-19 09:15:51
shuangzi8761
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4楼2011-10-19 10:30:16
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