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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌DH5α感受态细胞制备求助
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mxbeaver

木虫 (著名写手)

浪滔滔~人渺渺~
★
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你的DH5α有抗性么？改造过的么？
原始的DH5α没有抗性，在空白的LB或SOB平板上划线然后挑单菌落培养就可以了。
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11楼2010-07-20 15:21:38
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lixian2404

银虫 (初入文坛)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-25 08:19:02
在普通的LB 培养基上活化 24小时 然后再摇菌 按 1:100比例加入到新制备的LB液体培养基上 震荡培养2小时左右 到其OD值大概在0.4左右 冰浴30分钟  4度离心 10分钟去上清  按1:10的比例加入 TSS  再分装就是感受态细胞了
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WADE
12楼2010-10-24 17:36:58
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)

北斗星
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-25 08:19:11
个人用CaCl2法制备，挺好用的。步骤：过夜活化好的DH5α取1mL转接到新的液体LB中培养至OD600=0.4左右，冰浴30min，4℃、4000rpm离心收集菌体，第一次用冰浴0.1MCaCl2溶液重悬菌体，4℃、4000rpm离心收集菌体，冰浴30min，第二次用冰浴0.1MCaCl2+15%甘油重悬菌体，分装于1.5mL离心管100μL/管，-70℃冰箱保存备有半年。注意重悬菌体在冰浴中操作。
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海阔凭鱼跃，天高任鸟飞！
13楼2010-10-24 23:47:45
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Lee_Py

银虫 (小有名气)
★
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楼主可以买嘛  还自己做啥
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14楼2010-10-25 16:17:34
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tian1203

银虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Lee_Py at 2010-10-25 16:17:34:
楼主可以买嘛  还自己做啥

谢谢，后来的做的几批都可以，之前做的多但不精
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别紧张，我不是什么好人...
15楼2010-10-26 10:25:44
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
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将大肠杆菌DH5α贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃过夜培养；
挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200-210rpm振荡培养过夜；
次日，按1%（v/v）接入新鲜的LB液体培养基，37℃，250rpm震荡培养至OD600为0.3-0.5左右；
将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置10min后，4℃，3,500rpm，离心10min；
弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积的无菌、预冷的终浓度为20mmol/L的CaCl2和80mmol/L的MgCl2溶液中，4℃，3,500rpm，离心10min；
弃上清，再将菌体悬浮于1/50体积的预冷的0.1mol/L的无菌CaCl2溶液中，即为感受态细胞；
加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20%；
分装于1.5ml的Eppendorf管中，液氮速冻后，于-80℃冰箱中冻存，备用。
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16楼2010-10-26 10:46:25
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
10楼: Originally posted by shenlin0514 at 2010-07-20 15:11:18:
DH5a是不含抗性基因的大肠杆菌重组菌株，不能直接涂氨苄平板，建议采用qiagen的制备感受态方法，直接上qiagen网站找到download进行下载

我找了半天没找到啊，能具体点说下找qiagen的制备感受态细胞的方法吗
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好孩子！
17楼2012-02-28 15:08:51
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-02-28 15:08:51:
我找了半天没找到啊，能具体点说下找qiagen的制备感受态细胞的方法吗

直接下载吧，我上传了
感受态制作溶液配方在50页TFB1和TFB2
制作方法在55页
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Never say never
18楼2012-02-29 16:07:57
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by shenlin0514 at 2012-02-29 16:07:57:
直接下载吧，我上传了
感受态制作溶液配方在50页TFB1和TFB2
制作方法在55页

你太好啦
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好孩子！
19楼2012-02-29 16:46:50
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by shenlin0514 at 2012-02-29 16:07:57:
直接下载吧，我上传了
感受态制作溶液配方在50页TFB1和TFB2
制作方法在55页

你太好啦
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好孩子！
20楼2012-02-29 16:47:22
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