24小时热门版块排行榜    

查看: 2005  |  回复: 14

miya173

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 17:00:41:
楼主的模板很珍贵或者很难得到吗?
点突变要重新设计引物,经过一轮超长时间的PCR,还要消化模板再转化、筛选,最后测序(还有可能错)。也算是个中等规模的实验了。

请楼主详细说明一下,重新扩增为什么比点 ...

是的,请说明一下为什么重新扩增太费劲,我也没搞懂
11楼2010-05-19 17:54:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-05-19 13:05:41:
点突变吧。如果很多个突变,建议重新做一下。我也遇到过,好在是在引物端,延长引物后居然“盖”过去了。

怎么盖的。。。。
12楼2010-05-19 19:52:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 17:00:41:
楼主的模板很珍贵或者很难得到吗?
点突变要重新设计引物,经过一轮超长时间的PCR,还要消化模板再转化、筛选,最后测序(还有可能错)。也算是个中等规模的实验了。

请楼主详细说明一下,重新扩增为什么比点 ...

我不是扩了一个 是好几个片段呢 前段时间做酶切链接费了我俩月,要是重新做的话,又是很久很久了
13楼2010-05-19 19:54:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzhwin

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
那你是不是应该改良克隆的系统?克隆基因片段已经有很成熟而且很快速的解决方法了。除非你有上百个片段一次实验做不过来。一般十个以内的片段扩增以及鉴定应该能在10天以内完成。细算一下(最长时间):
合成引物:5天
PCR+电泳+胶回收+加A+连T载:12小时
转化大肠杆菌并培养:16小时
菌落PCR鉴定+液体培养阳性菌落:16小时
提质粒+酶切鉴定:5小时
测序:3天
合计约10天
合成引物我们一般3天  测序大概2天  
拓扑异构酶T载快速连接试剂盒可以再节省半天时间并且显著提高阳性率
况且你不需要合成引物了。

所以,究竟哪里浪费了你的时间?
重叠突变也需要重新设计引物,无论怎样突变比你单扩增片段要麻烦的多
14楼2010-05-19 22:44:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 22:44:45:
那你是不是应该改良克隆的系统?克隆基因片段已经有很成熟而且很快速的解决方法了。除非你有上百个片段一次实验做不过来。一般十个以内的片段扩增以及鉴定应该能在10天以内完成。细算一下(最长时间):
合成引物 ...

后续的酶切链接浪费了许久许久。。。。。到现在我都不知道连上没连上。。。拿去测序了。。。。
15楼2010-05-19 22:48:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yinsongna 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售T0P一区SCI文章,我:8O5.51.O.54,科目齐全,可+急 +3 68gx6bh3ei 2026-07-09 3/150 2026-07-10 06:33 by pbuc7it0i8
[硕博家园] 售T0P一区SCI文章,我:8O5.51.O.54,科目齐全,可+急 +3 ph7bxbho8f 2026-07-09 3/150 2026-07-10 05:53 by j4frgf6zcw
[教师之家] 售T0P一区SCI文章,我:8O5.51.O.54,科目齐全,可+急 +3 al9t2f50x3 2026-07-09 4/200 2026-07-10 05:33 by j4frgf6zcw
[考研] 售T0P一区SCI文章,我:8O5.51.O.54,科目齐全,可+急 +4 al9t2f50x3 2026-07-09 4/200 2026-07-10 05:33 by j4frgf6zcw
[基金申请] b口会评 +6 当空照 2026-07-08 6/300 2026-07-09 20:49 by tonyliu0401
[基金申请] 信息学部会评时间 +3 xuel2011 2026-07-06 3/150 2026-07-09 19:05 by mollyzhang_2003
[基金申请] 祈祷青基必中 50+3 hadengry 2026-07-09 9/450 2026-07-09 17:37 by 文杰猪猪
[考研] 在职考研 +6 wu5d 2026-07-08 7/350 2026-07-09 16:40 by 化工小霸王呀
[论文投稿] MSER送审了还被拒稿 +3 S778950906 2026-07-08 5/250 2026-07-09 15:46 by S778950906
[基金申请] 关于如何从代码看上不上会 +11 且听虎啸 2026-07-09 14/700 2026-07-09 15:27 by libeny
[有机交流] 硝基还原 20+3 暮年飞雪 2026-07-07 5/250 2026-07-09 13:30 by tfang
[基金申请] 化学口会评?应用基础研究和基础研究,希望能分开 +3 Tide man 2026-07-08 3/150 2026-07-09 11:36 by dede5556
[基金申请] 今年E04面上 +15 布布和一二 2026-07-05 21/1050 2026-07-09 10:25 by 学员fOzRO9
[硕博家园] 大龄残疾硕士的一点执念 +14 3776737374 2026-07-06 22/1100 2026-07-09 06:07 by lovechizi
[基金申请] 生命口会评 +4 wuke100666 2026-07-07 4/200 2026-07-08 16:38 by 逍遥不够自在
[教师之家] 网络举报学术不端成为了男女之间情杀的手段了,真荒唐。。。 +3 zju2000 2026-07-04 3/150 2026-07-07 21:00 by hyx552200
[有机交流] Suzuki偶联中硼酸酯原料掉下的硼酸酯是否可以自身偶联,生成B2Pin2杂质 500+3 天下大同 2026-07-06 3/150 2026-07-07 10:31 by martyr_oyx
[论文投稿] 刑法学论文投稿求助 +3 高源678 2026-07-04 5/250 2026-07-06 12:20 by 平天尺
[论文投稿] Journal of Environmental Chemical Engineering +3 雪花天涯 2026-07-05 3/150 2026-07-06 09:00 by bobvan
[基金申请] 最后一年,祈求好运 +3 pyw1992 2026-07-06 3/150 2026-07-06 08:53 by 苏_frp
信息提示
请填处理意见