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miya173

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 17:00:41:
楼主的模板很珍贵或者很难得到吗?
点突变要重新设计引物,经过一轮超长时间的PCR,还要消化模板再转化、筛选,最后测序(还有可能错)。也算是个中等规模的实验了。

请楼主详细说明一下,重新扩增为什么比点 ...

是的,请说明一下为什么重新扩增太费劲,我也没搞懂
11楼2010-05-19 17:54:08
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-05-19 13:05:41:
点突变吧。如果很多个突变,建议重新做一下。我也遇到过,好在是在引物端,延长引物后居然“盖”过去了。

怎么盖的。。。。
12楼2010-05-19 19:52:27
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 17:00:41:
楼主的模板很珍贵或者很难得到吗?
点突变要重新设计引物,经过一轮超长时间的PCR,还要消化模板再转化、筛选,最后测序(还有可能错)。也算是个中等规模的实验了。

请楼主详细说明一下,重新扩增为什么比点 ...

我不是扩了一个 是好几个片段呢 前段时间做酶切链接费了我俩月,要是重新做的话,又是很久很久了
13楼2010-05-19 19:54:08
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lzhwin

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
那你是不是应该改良克隆的系统?克隆基因片段已经有很成熟而且很快速的解决方法了。除非你有上百个片段一次实验做不过来。一般十个以内的片段扩增以及鉴定应该能在10天以内完成。细算一下(最长时间):
合成引物:5天
PCR+电泳+胶回收+加A+连T载:12小时
转化大肠杆菌并培养:16小时
菌落PCR鉴定+液体培养阳性菌落:16小时
提质粒+酶切鉴定:5小时
测序:3天
合计约10天
合成引物我们一般3天  测序大概2天  
拓扑异构酶T载快速连接试剂盒可以再节省半天时间并且显著提高阳性率
况且你不需要合成引物了。

所以,究竟哪里浪费了你的时间?
重叠突变也需要重新设计引物,无论怎样突变比你单扩增片段要麻烦的多
14楼2010-05-19 22:44:45
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yinsongna

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lzhwin at 2010-05-19 22:44:45:
那你是不是应该改良克隆的系统?克隆基因片段已经有很成熟而且很快速的解决方法了。除非你有上百个片段一次实验做不过来。一般十个以内的片段扩增以及鉴定应该能在10天以内完成。细算一下(最长时间):
合成引物 ...

后续的酶切链接浪费了许久许久。。。。。到现在我都不知道连上没连上。。。拿去测序了。。。。
15楼2010-05-19 22:48:29
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