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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why?
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小白兄

金虫 (小有名气)
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-19 09:12:02
能加对照加个对照，排除其他因素。我们PCR用不到那么大的体系，回收也就50ul很好的。1800bp延伸1min就够了。dmso是GC含量较高时加入降低退火温度增强特异性的。不是GC含量高的话，能不加就不加。
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时光如流水，匆匆而过。
11楼2010-05-19 00:39:01
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木子

银虫 (小有名气)
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scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-19 09:12:14
我的建议：
1、看看引物是否设计的正确
2、看看模板纯度是否很高
3、优化反应体系，如镁离子的浓度，引物浓度等，还有就是你的片段比较长，是否考虑预变性
4、退火温度的优化，可以做梯度PCR
5、梯度PCR一般从高于退火温度5度开始，到低于5度，可以每次降1度或者2度，体系25微升就可以乐，可以参阅相关文献，时间久了好多忘了
6、氯化钾，我从来没有加过，不知道你们是依据什么原理加的，镁离子的倒是需要优化的
希望对你有所帮助

[ Last edited by 木子 on 2010-5-19 at 08:36 ]
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12楼2010-05-19 08:35:19
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特洛伊

金虫 (小有名气)
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scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-19 09:12:34
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-05-18 22:34:57:

楼上的你们做pcr都加什么？
我们实验室其实原来都不用加什么氯化钾，等等，只需要加增强剂就可以了~原来很好做，最近大家的pcr都不太理想！

首先：100的体系没有做过，一般都是20-25的体系。
其次：如果是大家都出现的问题，我觉的最大的原因有可能是ddH2O的问题吧，  测下电导。
最后：一般的PCR体系基本固定，63度的退火温度可以+ -5度来筛选。
     
希望有所帮助。
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成本
13楼2010-05-19 08:49:28
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2007201050

木虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-19 09:12:46
我们是10UL体系，引物模板加1，酶加0.1，你的体系是不是太稀了，扩出的量太少，多以看不到，还有1800BP很大的片段，是不是要多跑一些，你确定你的叫没问题吗，把所有影响的因素都考虑一遍，说不定会找出原因呢
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14楼2010-05-19 09:09:21
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特洛伊

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by 2007201050 at 2010-05-19 09:09:21:
我们是10UL体系，引物模板加1，酶加0.1，你的体系是不是太稀了，扩出的量太少，多以看不到，还有1800BP很大的片段，是不是要多跑一些，你确定你的叫没问题吗，把所有影响的因素都考虑一遍，说不定会找出原因呢

南农的MM，你跟是那个组啊？做什么的？
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成本
15楼2010-05-19 09:38:26
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
多谢大家的建议啊~
我刚做了一个梯度！
52-62度，做了五个梯度，等会电泳结果怎么样~
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16楼2010-05-19 19:27:15
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
还得请教高手帮忙给点建议啊~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
17楼2010-05-20 18:15:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
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我想提醒楼主注意的问题有几点：
首先，楼主的体系太大了，正常来讲很多PCR都是有体系设置范围的，50一般是极限了，超过50，效果肯定不好了，而且也没有必要做这么大，很浪费，尤其在现在实验尚处于条件优化阶段，如果你的手法还不错，10ul体系是最好的，体系越小，越敏感，实验做得反而越漂亮
其次，你所说的师姐检查过引物是什么意思，是检查了引物设计有没有毛病，还是说这个引物以前曾经成功扩增出来过条带，如果是后者，那么可以排除引物问题，如果是前者，那么我认为目前不出带，最大的问题还是引物，引物设计这个东西，不代表设计得合理，符合原则，就能扩增出条带，很多情况就是运气
再次，楼主应该考虑模板的质量和浓度，最好有个阳性对照，就是类似实验的其他引物，可以成功扩增
最后，我想说的是，我上面所说的这些，都是建立在你实验的这套体系能够成功进行PCR的基础上的，因为楼主只给了加的量，而不是终浓度，所以我也无法判断体系是否存在问题
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18楼2010-05-20 18:42:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-20 18:42:59:
我想提醒楼主注意的问题有几点：
首先，楼主的体系太大了，正常来讲很多PCR都是有体系设置范围的，50一般是极限了，超过50，效果肯定不好了，而且也没有必要做这么大，很浪费，尤其在现在实验尚处于条件优化阶段 ...

很感谢您的建议！我回头做个对照看看！
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19楼2010-05-20 18:47:51
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2007201050

木虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by 特洛伊 at 2010-05-19 09:38:26:



南农的MM，你跟是那个组啊？做什么的？

棉花育种的，分子标记定位纤维QTL，以前PCR也出现过这种问题
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20楼2010-05-23 19:02:55
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