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小白兄

金虫 (小有名气)

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scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-19 09:12:02
能加对照加个对照,排除其他因素。我们PCR用不到那么大的体系,回收也就50ul很好的。1800bp延伸1min就够了。dmso是GC含量较高时加入降低退火温度增强特异性的。不是GC含量高的话,能不加就不加。
时光如流水,匆匆而过。
11楼2010-05-19 00:39:01
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木子

银虫 (小有名气)

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scelab(金币+3):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-19 09:12:14
我的建议:
1、看看引物是否设计的正确
2、看看模板纯度是否很高
3、优化反应体系,如镁离子的浓度,引物浓度等,还有就是你的片段比较长,是否考虑预变性
4、退火温度的优化,可以做梯度PCR
5、梯度PCR一般从高于退火温度5度开始,到低于5度,可以每次降1度或者2度,体系25微升就可以乐,可以参阅相关文献,时间久了好多忘了
6、氯化钾,我从来没有加过,不知道你们是依据什么原理加的,镁离子的倒是需要优化的
希望对你有所帮助

[ Last edited by 木子 on 2010-5-19 at 08:36 ]
12楼2010-05-19 08:35:19
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特洛伊

金虫 (小有名气)

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scelab(金币+3):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-19 09:12:34
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-05-18 22:34:57:

楼上的你们做pcr都加什么?
我们实验室其实原来都不用加什么氯化钾,等等,只需要加增强剂就可以了~原来很好做,最近大家的pcr都不太理想!

首先:100的体系没有做过,一般都是20-25的体系。
其次:如果是大家都出现的问题,我觉的最大的原因有可能是ddH2O的问题吧,  测下电导。
最后:一般的PCR体系基本固定,63度的退火温度可以+ -5度来筛选。
     
希望有所帮助。
成本
13楼2010-05-19 08:49:28
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2007201050

木虫 (小有名气)

★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-19 09:12:46
我们是10UL体系,引物模板加1,酶加0.1,你的体系是不是太稀了,扩出的量太少,多以看不到,还有1800BP很大的片段,是不是要多跑一些,你确定你的叫没问题吗,把所有影响的因素都考虑一遍,说不定会找出原因呢
14楼2010-05-19 09:09:21
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特洛伊

金虫 (小有名气)


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引用回帖:
Originally posted by 2007201050 at 2010-05-19 09:09:21:
我们是10UL体系,引物模板加1,酶加0.1,你的体系是不是太稀了,扩出的量太少,多以看不到,还有1800BP很大的片段,是不是要多跑一些,你确定你的叫没问题吗,把所有影响的因素都考虑一遍,说不定会找出原因呢

南农的MM,你跟是那个组啊?做什么的?
成本
15楼2010-05-19 09:38:26
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

多谢大家的建议啊~
我刚做了一个梯度!
52-62度,做了五个梯度,等会电泳结果怎么样~
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
16楼2010-05-19 19:27:15
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

还得请教高手帮忙给点建议啊~
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
17楼2010-05-20 18:15:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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我想提醒楼主注意的问题有几点:
首先,楼主的体系太大了,正常来讲很多PCR都是有体系设置范围的,50一般是极限了,超过50,效果肯定不好了,而且也没有必要做这么大,很浪费,尤其在现在实验尚处于条件优化阶段,如果你的手法还不错,10ul体系是最好的,体系越小,越敏感,实验做得反而越漂亮
其次,你所说的师姐检查过引物是什么意思,是检查了引物设计有没有毛病,还是说这个引物以前曾经成功扩增出来过条带,如果是后者,那么可以排除引物问题,如果是前者,那么我认为目前不出带,最大的问题还是引物,引物设计这个东西,不代表设计得合理,符合原则,就能扩增出条带,很多情况就是运气
再次,楼主应该考虑模板的质量和浓度,最好有个阳性对照,就是类似实验的其他引物,可以成功扩增
最后,我想说的是,我上面所说的这些,都是建立在你实验的这套体系能够成功进行PCR的基础上的,因为楼主只给了加的量,而不是终浓度,所以我也无法判断体系是否存在问题
18楼2010-05-20 18:42:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-20 18:42:59:
我想提醒楼主注意的问题有几点:
首先,楼主的体系太大了,正常来讲很多PCR都是有体系设置范围的,50一般是极限了,超过50,效果肯定不好了,而且也没有必要做这么大,很浪费,尤其在现在实验尚处于条件优化阶段 ...

很感谢您的建议!我回头做个对照看看!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
19楼2010-05-20 18:47:51
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2007201050

木虫 (小有名气)


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引用回帖:
Originally posted by 特洛伊 at 2010-05-19 09:38:26:



南农的MM,你跟是那个组啊?做什么的?

棉花育种的,分子标记定位纤维QTL,以前PCR也出现过这种问题
20楼2010-05-23 19:02:55
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