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天使托

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T.Shen

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[交流] 【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why? 已有10人参与

今天偶做了一个pcr，目的片段1800多bp，退火温度63，延伸2Min,不料做完之后电泳没有条带！不知道是何原因？

ps:100微升体系，10 buffer 5 DMSO 75 ddH2O dNTP 引物模板酶都是2 没有加氯化钾，因为近来实验室都说加了氯化钾做不出来！

请高手帮忙分析原因？
还有我明天想做一个梯度，不知道设几个梯度好？还有如果做梯度的话，每一管做多少微升合适？

谢谢高手了！

5.20更新今天中午又去做了一个pcr，这次我做的是10微升体系的，分别用两种酶（鼎国的和pfu酶）各做了五个梯度，54 56 58 60 62度，结果下午去跑电泳还是没有任何条带，我考虑到是不是引物没有稀释均匀的问题，随后又对我的引物进行了电泳，点了5微升，有条带很亮！

目前已经可以排除引物的问题（因为我引物设计完成后让师姐都检查了一下，而且今天也排除了引物稀释均匀的问题）；
现在我也不知道到底是什么问题了？大家有什么更好的建议没有？
有哪位仁兄用过pcr增强剂?

[ Last edited by 天使托 on 2010-5-20 at 18:45 ]

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

1楼 2010-05-18 22:19:21

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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

我想提醒楼主注意的问题有几点：
首先，楼主的体系太大了，正常来讲很多PCR都是有体系设置范围的，50一般是极限了，超过50，效果肯定不好了，而且也没有必要做这么大，很浪费，尤其在现在实验尚处于条件优化阶段，如果你的手法还不错，10ul体系是最好的，体系越小，越敏感，实验做得反而越漂亮
其次，你所说的师姐检查过引物是什么意思，是检查了引物设计有没有毛病，还是说这个引物以前曾经成功扩增出来过条带，如果是后者，那么可以排除引物问题，如果是前者，那么我认为目前不出带，最大的问题还是引物，引物设计这个东西，不代表设计得合理，符合原则，就能扩增出条带，很多情况就是运气
再次，楼主应该考虑模板的质量和浓度，最好有个阳性对照，就是类似实验的其他引物，可以成功扩增
最后，我想说的是，我上面所说的这些，都是建立在你实验的这套体系能够成功进行PCR的基础上的，因为楼主只给了加的量，而不是终浓度，所以我也无法判断体系是否存在问题