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天使托专家顾问 (职业作家)
T.Shen
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[交流]
【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why? 已有10人参与
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今天偶做了一个pcr，目的片段1800多bp，退火温度63，延伸2Min,不料做完之后电泳没有条带！不知道是何原因？ ps:100微升体系，10 buffer 5 DMSO 75 ddH2O dNTP 引物 模板 酶 都是2 没有加氯化钾，因为近来实验室都说加了氯化钾做不出来！ 请高手帮忙分析原因？ 还有我明天想做一个梯度，不知道设几个梯度好？还有如果做梯度的话，每一管做多少微升合适？ 谢谢高手了！ 5.20更新今天中午又去做了一个pcr，这次我做的是10微升体系的，分别用两种酶（鼎国的和pfu酶）各做了五个梯度，54 56 58 60 62度，结果下午去跑电泳还是没有任何条带，我考虑到是不是引物没有稀释均匀的问题，随后又对我的引物进行了电泳，点了5微升，有条带很亮！ 目前已经可以排除引物的问题（因为我引物设计完成后让师姐都检查了一下，而且今天也排除了引物稀释均匀的问题）； 现在我也不知道到底是什么问题了？大家有什么更好的建议没有？ 有哪位仁兄用过pcr增强剂? [ Last edited by 天使托 on 2010-5-20 at 18:45 ] |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-19 09:12:14
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scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-19 09:12:14
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我的建议： 1、看看引物是否设计的正确 2、看看模板纯度是否很高 3、优化反应体系，如镁离子的浓度，引物浓度等，还有就是你的片段比较长，是否考虑预变性 4、退火温度的优化，可以做梯度PCR 5、梯度PCR一般从高于退火温度5度开始，到低于5度，可以每次降1度或者2度，体系25微升就可以乐，可以参阅相关文献，时间久了好多忘了 6、氯化钾，我从来没有加过，不知道你们是依据什么原理加的，镁离子的倒是需要优化的 希望对你有所帮助 [ Last edited by 木子 on 2010-5-19 at 08:36 ] |
12楼2010-05-19 08:35:19
scelab
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氯化钾
2楼2010-05-18 22:31:10
天使托
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3楼2010-05-18 22:34:57
scelab
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4楼2010-05-18 22:36:47