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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助一个很奇怪的PCR现象
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qqsvery

木虫 (著名写手)
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
是否可以考虑分步PCR，这么多引物序列加进去，特异性会下降的，而且各自的序列长度是多少，在泳道上好区分么？
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
11楼2010-05-08 10:11:21
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匿名

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12楼2010-05-08 10:21:11
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
反向引物大概多长呢？
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13楼2010-05-08 10:22:37
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3sgentlman

金虫 (小有名气)
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
学习一下！
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路是大家共同开发的！
14楼2010-05-08 10:23:02
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
我也设计带酶切位点的引物，不过一直没有从cDNA上扩出来目的片段，退火温度甚至都低到快40度了。很是郁闷。我只知道酶切位点前面加2-3个碱基为好，不能多。其他就不知了。
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15楼2010-05-08 11:08:33
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
r1 r2 恐怕有问题
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海纳百川止于至善
16楼2010-05-08 11:19:58
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keeperw

捐助贵宾 (小有名气)
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
差一两个碱基P不出来很正常，可能是引物设计方面的原因
最重要的两条：两条引物3‘结合效率和特异性；两条引物的退火温度一定要尽量一致；
做到这两点，基本上就不会有问题了
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17楼2010-05-08 14:44:25
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匿名

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18楼2010-05-08 16:19:43
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
a4182009(金币+3):谢谢参与
问题没看懂 你要F1 R1的产物 用F1和R2配对干吗？
R1 R2没有序列我没办法帮你判断
两对引物要退火合适才行  你试试 AT*2+GC*4 把两对引物的数值比较一下 差2或不差就对了
注意不要算保护碱基在内 单指完全配对部分

模板的GC含量或宿主Genome的GC含量告诉我

菌液直接P？那把95度改到5min 热裂解一下

什么菌？ 大肠可以这么干，假单胞勉强可以，放线菌不行，分枝杆菌也不保证，还有些别的菌不列了
实在不行提个总DNA再P

PCR第一步是95度变性 不是退火 你程序怎么设的？最后一句也没看懂 什么叫加一个碱基就P不出来啊 加了这么多酶切位点？ 加一个减少一个它还就有p不出来的时候 PCR就是这么怪  酶切位点不算在内的 引物分析只算完全配对部分

原因很多 从你的描述就只能分析这些
有问题再联系
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Bemühen Sie !
19楼2010-05-08 16:43:04
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匿名

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20楼2010-05-08 18:54:48
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