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[交流]
【求助/交流】植物细胞膜蛋白提取 已有2人参与
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| 请问各位虫友，有谁提取过植物细胞膜蛋白？用什么方法最好？谢谢 |
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wuweibewin
金虫 (正式写手)
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- 专业: 作物分子育种
本实验室就是这么做的
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
plantaqp(金币+3): 2010-04-29 04:32
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植物质膜提取与纯化 一、试剂 Hepes，Tris，MES，EDTA，山梨醇，PSFM，BSA，均购于北京经科宏达生物技术公司。 研钵，研槌，玻璃匀浆器，纱布，高速离心机，超速离心机，离心管（50mL），超速离心管（26mL）. 二、操作步骤 1．质膜粗提 1）组织20g (fw) 液氮研碎 2）转入预冷研钵（4度） 3）加入冰浴匀浆液 50ml （匀浆液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 8.0, 山莉醇0.25 M, PMSF 1mM，BSA 0.5%,） 4）冰浴匀浆5 分钟 5）过滤 （3层纱布） 6）滤液10000g 4度离心15分钟 7）上清 80000g 4度40 min 8）沉淀小体积2毫升悬浮. 悬浮液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 6.0. 9）玻璃匀浆器匀浆数次 2．用两相法进一步纯化 1) 两相系统：精确配制 PEG 3350 6.4% (w/w), 葡聚糖500 6.4% (w/w), 山莉醇 0.25 M MES 5 mM pH 6.0 2) 粗质膜悬液1/15（v/v）与两相系统混合(轻) 3）4 度1000g 5 分钟。 4）上清再与两相系统液混合 5）4 度1000g 5 分钟。 6）上清再与两相系统液混合 7）4 度1000g 5 分钟 8）收集上清。 3．纯质膜悬液 1)上清稀释3倍 (稀释液：MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M) 2) 120000 g 离心 40 分钟 4度。 3）沉淀小体积300微升悬浮 （悬浮液MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M) 三、注意事项： 1． 一切操作均在低温下进行。 2． 两相系统配制要精确。 3． 相转移时要轻吸轻放。 4． 悬浮质膜体积尽量小，且至少洗涤三次管底。 |
2楼2010-04-28 09:18:37
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