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virus2009

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】植物细胞膜蛋白提取已有2人参与

请问各位虫友，有谁提取过植物细胞膜蛋白？用什么方法最好？谢谢

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virus

1楼 2010-04-27 20:48:24

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wuweibewin

金虫 (正式写手)

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本实验室就是这么做的

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
plantaqp(金币+3): 2010-04-29 04:32

植物质膜提取与纯化

一、试剂
Hepes，Tris，MES，EDTA，山梨醇，PSFM，BSA，均购于北京经科宏达生物技术公司。
研钵，研槌，玻璃匀浆器，纱布，高速离心机，超速离心机，离心管（50mL），超速离心管（26mL）.
二、操作步骤
1．质膜粗提
1）组织20g (fw) 液氮研碎
2）转入预冷研钵（4度）
3）加入冰浴匀浆液 50ml （匀浆液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 8.0, 山莉醇0.25 M, PMSF 1mM，BSA 0.5%,）
4）冰浴匀浆5 分钟
5）过滤（3层纱布）
6）滤液10000g 4度离心15分钟
7）上清 80000g 4度40 min
8）沉淀小体积2毫升悬浮. 悬浮液：Hepes-tris 20 mM pH 7.8, EDTA 1 mM pH 6.0.
9）玻璃匀浆器匀浆数次
2．用两相法进一步纯化
1) 两相系统：精确配制 PEG 3350 6.4% (w/w), 葡聚糖500 6.4% (w/w), 山莉醇 0.25 M
MES 5 mM pH 6.0
2) 粗质膜悬液1/15（v/v）与两相系统混合(轻)
3）4 度1000g 5 分钟。
4）上清再与两相系统液混合
5）4 度1000g 5 分钟。
6）上清再与两相系统液混合
7）4 度1000g 5 分钟
8）收集上清。
3．纯质膜悬液
1)上清稀释3倍 (稀释液：MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M)
2) 120000 g 离心 40 分钟 4度。
3）沉淀小体积300微升悬浮（悬浮液MES 5 mM pH 6.0, 山莉醇 0.25 M)
三、注意事项：
1．一切操作均在低温下进行。
2．两相系统配制要精确。
3．相转移时要轻吸轻放。
4．悬浮质膜体积尽量小，且至少洗涤三次管底。