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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教native page的相关知识
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marc0907

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教native page的相关知识 已有3人参与

想做一下native page ，但是对于其中的一些诀窍，还不是很清楚，所以想请教各位大侠，能否给小弟上一课，小弟在此先谢了！哈哈！
对于其中涉及到的一些试剂，小弟已经有所了解了，不太明白的主要集中于如何做胶，如何处理样品及maker，还有电泳过程中的一些参数设置及注意点，小弟在此先谢了
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1楼 2010-04-24 19:05:43
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
marc0907(金币+2): 2010-04-24 22:32
scelab(金币+8):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-25 21:15
做胶得先明白的要跑的样品的酸碱性，如果是蛋白一般可以预测一下等电点。
等明确了酸碱后就考虑你的胶浓度，写好配方
然后就可以配胶了，操作跟非变性胶差不多。但是胶板之类的不要跟变性胶的混用了。
非变性胶可以多加点temed，多凝一些时间。
非变性胶一般用前需要预电泳，我一般100V，1h。
电泳我一般4度冷库10mA稳流，有时候也用100V稳压
酸性样品电泳跟变性的差不多
碱性的需要电极倒置
样品只要不是离子浓度太高，没什么大问题
其实你一用搜索，讲native胶的原理制作注意事项常见问答的有一堆
我虽然做过这个，但确实不是高手，不能教你什么技术
我想跟你说的，是学习的方法，在希望别人能给自己上一课的时候，
自己先预习一下，网上那么多资料，你看的多了自然心中有数。再有针对性的提出不懂的问题，也让后面的高手老师们心里有个底
网上不缺乏热心的高手，但是高手的时间也是时间，你搜索可以解决的问题为什么非得让他们再给你打一遍或复制一遍？
看你其实还是看了点资料的，那么你提问的时候能不能问的稍微具体点呢？那么多样品你是希望得到标准回答各种样品如何处理？其实问题问的越详细解决的越简单。

特殊时期内分泌不稳中，乱说一堆，见谅
其实只是我的沙发控发作了

[ Last edited by zjzz on 2010-4-24 at 20:02 ]
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终于熬成木虫了……
2楼2010-04-24 19:52:12
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普通回帖

marc0907

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by marc0907 at 2010-04-24 19:05:43:
想做一下native page ，但是对于其中的一些诀窍，还不是很清楚，所以想请教各位大侠，能否给小弟上一课，小弟在此先谢了！哈哈！
对于其中涉及到的一些试剂，小弟已经有所了解了，不太明白的主要集中于如何做胶， ...

小弟也确实看了很多资料，也请教了一位曾今做个native page的师姐，紧随其后我也做了一次实验，但是实验以失败告终，那我就说一下，试验中的情况和结果中出现的情况：1、事先，小弟也进行了预电泳，时间为半小时，不知道是不是短了一些；2、电泳过程中，我不能很确定其是否为较低的情况下进行的，因为，我只是将电泳槽整体放在冰上；3、试验中，由于不知道如何处理样品，只是将样品和上样缓冲液混合了一下，不知道有没有影响（marker事先我煮了几分钟）；4、上样时发现，样品并未像marker一样，成股留流下，而是分叉的多股流下，不知道有没有影响（甘油浓度绝对没问题）；5上样时，我加了两个不同的marker，以判断其大小，但是很奇怪的是，两个marker都有很严重的拖尾现象（之前和之后的人用了都没有问题）
看了上面的情况，不知道大侠有什么看法，和对我试验的一些建议！
小弟在此感激不尽！
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3楼2010-04-24 22:47:52
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marc0907

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-04-24 19:52:12:
做胶得先明白的要跑的样品的酸碱性，如果是蛋白一般可以预测一下等电点。
等明确了酸碱后就考虑你的胶浓度，写好配方
然后就可以配胶了，操作跟非变性胶差不多。但是胶板之类的不要跟变性胶的混用了。
非变性胶 ...

小弟也确实看了很多资料，也请教了一位曾今做过native page的师姐，紧随其后我也做了一次实验，但是实验以失败告终，那我就说一下，试验中的情况和结果中出现的情况：
1、事先，小弟也进行了预电泳，时间为半小时，不知道是不是短了一些；
2、电泳过程中，我不能很确定其是否为较低的温度下进行的，因为，我只是将电泳槽整体放在冰上；
3、试验中，由于不知道如何处理样品，只是将样品和上样缓冲液混合了一下，不知道有没有影响（marker事先我煮了几分钟）；
4、上样时发现，样品并未像marker一样，成股流下，而是分叉的多股流下，不知道有没有影响（甘油浓度绝对没问题）；
5上样时，我加了两个不同的marker，以判断其大小，但是很奇怪的是，两个marker都有很严重的拖尾现象（对于marker，之前和之后的人用了都没有问题）
看了上面的情况，不知道大侠有什么看法，和对我试验的一些建议！
小弟在此感激不尽！

[ Last edited by marc0907 on 2010-4-24 at 22:53 ]
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4楼2010-04-24 22:48:51
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marc0907

金虫 (小有名气)
还有哪位大侠能够帮助小弟解答一下！
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5楼2010-04-25 12:18:09
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shwang007

木虫 (正式写手)
不明的你是做什么NATIVE-PAGE，其实很简单，与一般的PAGE不同的是非变性胶，不同的酶染色液不同
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6楼2010-04-25 20:02:59
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
marc0907(金币+3): 2010-04-26 21:47
引用回帖:
Originally posted by marc0907 at 2010-04-24 22:48:51:

小弟也确实看了很多资料，也请教了一位曾今做过native page的师姐，紧随其后我也做了一次实验，但是实验以失败告终，那我就说一下，试验中的情况和结果中出现的情况：
1、事先，小弟也进行了预电泳，时间为半小 ...

1.预电泳也有人跑半个小时的，不过我个人觉得短了点。
2，一定要低温电泳，因为电泳会产热，会导致变性。预电泳也最好低温。
   我在4°冷库电泳
3.拖尾严重和分股进入有可能是因为上样样品没有处理好，建议上样前将样品12000rpm离心1~2分钟，取上清进样
  也可能是你的胶没有凝好，制胶的时候多放会，或提前一天制好
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终于熬成木虫了……
7楼2010-04-26 19:11:27
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marc0907

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-04-26 19:11:27:

1.预电泳也有人跑半个小时的，不过我个人觉得短了点。
2，一定要低温电泳，因为电泳会产热，会导致变性。预电泳也最好低温。
   我在4°冷库电泳
3.拖尾严重和分股进入有可能是因为上样样品没有处理好，建议 ...

谢谢这位大侠，小弟感激涕零！

[ Last edited by marc0907 on 2010-4-26 at 21:49 ]
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8楼2010-04-26 21:48:51
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lindsay627

银虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
因为最近也要进行非变性电泳，想问下，电极倒置是什么有意思？
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9楼2011-12-20 15:29:20
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1261978楼: Originally posted by lindsay627 at 2011-12-20 15:29:20
因为最近也要进行非变性电泳，想问下，电极倒置是什么有意思？

电极倒置就是红色接负极，黑色接正极
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10楼2012-10-17 12:07:34
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