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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于PCR条带问题
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xiaoru2010

[交流] 【求助/交流】关于PCR条带问题 已有4人参与

求助高手：
问题一，用简并引物扩出六七条带，但特异性不明显，是什么问题，能通过调整PCR条件解决吗？
问题二，出现从点样孔开始拖带，是不是RNA里糖太多啊？怎么解决呢？
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1楼 2010-04-19 10:04:42
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 2010-04-19 11:13
第一个问题：可以尝试一下加大模板与引物的比例，退火温度增高一点
第二个问题：胶：制好以后最好在4度TAE放置一下
     记得反馈效果哈
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-04-19 11:02:11
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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 2010-04-19 11:13
增强特异性可以降低镁离子浓度，或者提高退火温度，适当降低循环数。你可以做温度梯度PCR。
拖带也有可能是模板浓度过高吧。如果用的cDNA最好稀释后再做模板。你可以试试模板浓度梯度，比如稀释10倍，100倍的，看看。
赞一下(2人) 回复此楼
scienceisnature
3楼2010-04-19 11:09:06
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
使用简并引物，很有可能特异性就是不好，如楼上两位所说调整一下，但有可能调整也是徒劳。看看楼主的目的是什么，一般测序的话就把目的片段处的条带切胶回收就行了，有杂带也无所谓
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4楼2010-04-19 11:52:00
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 邓远洪dyh at 2010-04-19 11:02:11:
第一个问题：可以尝试一下加大模板与引物的比例，退火温度增高一点
第二个问题：胶：制好以后最好在4度TAE放置一下
     记得反馈效果哈

首先感谢！
1 退火温度增高，同一对引物有些没有带，有些还是弥散
2 胶肯定没问题，因为同一个胶里有些又带的，别的弥散的就肯定是没扩出来
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5楼2010-04-22 08:49:32
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 风中摇曳 at 2010-04-19 11:09:06:
增强特异性可以降低镁离子浓度，或者提高退火温度，适当降低循环数。你可以做温度梯度PCR。
拖带也有可能是模板浓度过高吧。如果用的cDNA最好稀释后再做模板。你可以试试模板浓度梯度，比如稀释10倍，100倍的，看 ...

以前稀释过，全部没有东西，而且现在有些引物扩出来的，都没有稀释，而且要连P2-3次。
谢谢！
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6楼2010-04-22 08:51:07
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-19 11:52:00:
使用简并引物，很有可能特异性就是不好，如楼上两位所说调整一下，但有可能调整也是徒劳。看看楼主的目的是什么，一般测序的话就把目的片段处的条带切胶回收就行了，有杂带也无所谓

谢谢！
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7楼2010-04-22 08:53:58
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